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疯子J-F

木虫 (著名写手)

[求助] 330和1900两段overlap结果是这样,怎么改进呢? 已有2人参与

第一张是两片段胶回收产物电泳,后一张是overlap结果,片段比例10:1,退火温度用的55℃,求大神指点改进,谢谢了。。。

330和1900两段overlap结果是这样,怎么改进呢?
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330和1900两段overlap结果是这样,怎么改进呢?-1
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
疯子J-F: 金币+2, 有帮助 2015-10-29 21:33:22
你增加退火温度,或者gradient试试。一般两个条带我都是在同一个管子里回收的,然后用F1+R2做引物P一下就妥妥的。我一般都喜欢两步法,所以再设计引物的时候,都是把所有引物的TM设计在68度以上。这样会不用考虑退火的问题了。
2楼2015-10-29 14:50:30
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疯子J-F

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 14:50:30
你增加退火温度,或者gradient试试。一般两个条带我都是在同一个管子里回收的,然后用F1+R2做引物P一下就妥妥的。我一般都喜欢两步法,所以再设计引物的时候,都是把所有引物的TM设计在68度以上。这样会不用考虑退火 ...

68℃的退火?我62℃都觉得够高了,一般都是50-60之间的退火,混在一起回收不用考虑比例的问题么

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3楼2015-10-29 21:35:26
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-10-29 23:04:49
疯子J-F: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-10-30 08:28:51
我设计的引物都是用于无缝克隆的,所以长度都在50-60bp,退火温度一般都在65-80度,没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例,因为你overlap的时候有一个分子搭上了,后续就可以以这个为模板P得出来,就不会有问题!无数次的经验了。
4楼2015-10-29 22:49:16
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疯子J-F

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 22:49:16
我设计的引物都是用于无缝克隆的,所以长度都在50-60bp,退火温度一般都在65-80度,没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例,因为你overlap的时候有一个分子搭上了,后续就可以以这个为模板P得出来,就不会有问题! ...

好的谢谢,我试试

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5楼2015-10-30 08:29:23
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药到命除0

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 22:49:16
我设计的引物都是用于无缝克隆的,所以长度都在50-60bp,退火温度一般都在65-80度,没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例,因为你overlap的时候有一个分子搭上了,后续就可以以这个为模板P得出来,就不会有问题! ...

我们实验室也在试重叠延伸pcr,效果很不好,很想讨教经验啊!

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6楼2015-10-30 09:10:48
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上官寒武

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 22:49:16
我设计的引物都是用于无缝克隆的,所以长度都在50-60bp,退火温度一般都在65-80度,没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例,因为你overlap的时候有一个分子搭上了,后续就可以以这个为模板P得出来,就不会有问题! ...

你好  我最近也在做无缝克隆 不知道你做的一般是多大的片段  同源区一般都有多大啊  延伸时间是按照酶的正常的速度来的吗
7楼2015-10-30 10:08:06
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andywang6137

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 14:50:30
你增加退火温度,或者gradient试试。一般两个条带我都是在同一个管子里回收的,然后用F1+R2做引物P一下就妥妥的。我一般都喜欢两步法,所以再设计引物的时候,都是把所有引物的TM设计在68度以上。这样会不用考虑退火 ...

你好,请问这是一个基因的两个片段吗?做overlap的作用是什么?不太懂,请指教。谢谢!
8楼2015-10-30 17:01:32
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疯子J-F

木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by andywang6137 at 2015-10-30 17:01:32
你好,请问这是一个基因的两个片段吗?做overlap的作用是什么?不太懂,请指教。谢谢!...

可以突变掉重复的酶切位点,我觉得是主要作用吧,不然的话完全可以直接扩完整的片段

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9楼2015-10-30 18:34:29
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疯子J-F

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 上官寒武 at 2015-10-30 10:08:06
你好  我最近也在做无缝克隆 不知道你做的一般是多大的片段  同源区一般都有多大啊  延伸时间是按照酶的正常的速度来的吗...

我做的一般是2300-2500之间的,主要是想突变掉多余的酶切位点,防止构建重组质粒时把目的片段切碎了

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10楼2015-10-30 18:36:55
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