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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 330和1900两段overlap结果是这样，怎么改进呢？
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疯子J-F

木虫 (著名写手)

[求助] 330和1900两段overlap结果是这样，怎么改进呢？ 已有2人参与

第一张是两片段胶回收产物电泳，后一张是overlap结果，片段比例10:1，退火温度用的55℃，求大神指点改进，谢谢了。。。

330和1900两段overlap结果是这样，怎么改进呢？
w100h2150707_1446038984_731.jpg


330和1900两段overlap结果是这样，怎么改进呢？-1
w100h2150707_1446039009_526.jpg
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1楼 2015-10-28 21:53:25
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
疯子J-F: 金币+2, ★有帮助 2015-10-29 21:33:22
你增加退火温度，或者gradient试试。一般两个条带我都是在同一个管子里回收的，然后用F1+R2做引物P一下就妥妥的。我一般都喜欢两步法，所以再设计引物的时候，都是把所有引物的TM设计在68度以上。这样会不用考虑退火的问题了。
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2楼2015-10-29 14:50:30
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疯子J-F

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 14:50:30
你增加退火温度，或者gradient试试。一般两个条带我都是在同一个管子里回收的，然后用F1+R2做引物P一下就妥妥的。我一般都喜欢两步法，所以再设计引物的时候，都是把所有引物的TM设计在68度以上。这样会不用考虑退火 ...

68℃的退火？我62℃都觉得够高了，一般都是50-60之间的退火，混在一起回收不用考虑比例的问题么

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3楼2015-10-29 21:35:26
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-10-29 23:04:49
疯子J-F: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-10-30 08:28:51
我设计的引物都是用于无缝克隆的，所以长度都在50-60bp，退火温度一般都在65-80度，没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例，因为你overlap的时候有一个分子搭上了，后续就可以以这个为模板P得出来，就不会有问题！无数次的经验了。
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4楼2015-10-29 22:49:16
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疯子J-F

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 22:49:16
我设计的引物都是用于无缝克隆的，所以长度都在50-60bp，退火温度一般都在65-80度，没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例，因为你overlap的时候有一个分子搭上了，后续就可以以这个为模板P得出来，就不会有问题！ ...

好的谢谢，我试试

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5楼2015-10-30 08:29:23
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药到命除0

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 22:49:16
我设计的引物都是用于无缝克隆的，所以长度都在50-60bp，退火温度一般都在65-80度，没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例，因为你overlap的时候有一个分子搭上了，后续就可以以这个为模板P得出来，就不会有问题！ ...

我们实验室也在试重叠延伸pcr，效果很不好，很想讨教经验啊！

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6楼2015-10-30 09:10:48
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上官寒武

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 22:49:16
我设计的引物都是用于无缝克隆的，所以长度都在50-60bp，退火温度一般都在65-80度，没问题的。回收的时候根本不需要考虑比例，因为你overlap的时候有一个分子搭上了，后续就可以以这个为模板P得出来，就不会有问题！ ...

你好  我最近也在做无缝克隆 不知道你做的一般是多大的片段  同源区一般都有多大啊  延伸时间是按照酶的正常的速度来的吗
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7楼2015-10-30 10:08:06
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andywang6137

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-29 14:50:30
你增加退火温度，或者gradient试试。一般两个条带我都是在同一个管子里回收的，然后用F1+R2做引物P一下就妥妥的。我一般都喜欢两步法，所以再设计引物的时候，都是把所有引物的TM设计在68度以上。这样会不用考虑退火 ...

你好，请问这是一个基因的两个片段吗？做overlap的作用是什么？不太懂，请指教。谢谢！
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8楼2015-10-30 17:01:32
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疯子J-F

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by andywang6137 at 2015-10-30 17:01:32
你好，请问这是一个基因的两个片段吗？做overlap的作用是什么？不太懂，请指教。谢谢！...

可以突变掉重复的酶切位点，我觉得是主要作用吧，不然的话完全可以直接扩完整的片段

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9楼2015-10-30 18:34:29
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疯子J-F

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 上官寒武 at 2015-10-30 10:08:06
你好  我最近也在做无缝克隆 不知道你做的一般是多大的片段  同源区一般都有多大啊  延伸时间是按照酶的正常的速度来的吗...

我做的一般是2300-2500之间的，主要是想突变掉多余的酶切位点，防止构建重组质粒时把目的片段切碎了

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10楼2015-10-30 18:36:55
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