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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物合成回来后，前后引物的Tm值相差将近9度，问PCR时退火温度该如何设定？
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踏雪无痕love

金虫 (正式写手)

[求助] 引物合成回来后，前后引物的Tm值相差将近9度，问PCR时退火温度该如何设定？ 已有4人参与

如题，在此请教各位虫友，遇到这种情况该怎么办？
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1楼 2015-10-27 00:16:01
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seo.d_park

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你 用gradient 方法 测试 一下 引物 退火温度， 比如A 是56度 B是 65度 ，取4-6个温度点（56，58，60，62，64） ，cycle 首先 试试30周期， 如果某个温度点能有条带能观察到，再降低 周期数。

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2楼2015-10-27 08:16:00
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海里的淡水鱼

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
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3楼2015-10-27 08:16:26
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199006287956

木虫 (著名写手)
没有严格的规定说相差9度就不能跑出条带，最好是相差不多，退火温度50-65都可以，48度也行，48度以下的退火温度没有用过，本人习惯52-60度左右。本站有资料，下载自己看一下，设计引物稍微注意一下设计原则基本无碍。

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追求不惜，奋斗不息
4楼2015-10-27 08:16:38
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hcf321283

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以尝试使用touch down反应程序把你的退火温度包含进去。
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5楼2015-10-27 09:35:15
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天龙n部

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其实，你做多了，这都不是问题，我都尝试过上游100度bp的引物，下游20度bp的引物还是可以很好P的。touch down PCR，巢式PCR等我个人认为是在模板高GC或者有高级结构时采用会比较好，其他普通PCR条件完全可以了，我引物退火温度从来不考虑，常年60度，简单模板从来没有出问题（5年经验）最后祝好运吧
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6楼2015-10-28 15:29:25
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