【答案】应助回帖

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1楼2015-10-27 00:16:01

seo.d_park

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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建议你用gradient 方法测试一下引物退火温度，比如A 是56度 B是 65度，取4-6个温度点（56，58，60，62，64），cycle 首先试试30周期，如果某个温度点能有条带能观察到，再降低周期数。

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2楼2015-10-27 08:16:00

海里的淡水鱼

禁虫 (小有名气)

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3楼2015-10-27 08:16:26

199006287956

木虫 (著名写手)

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没有严格的规定说相差9度就不能跑出条带，最好是相差不多，退火温度50-65都可以，48度也行，48度以下的退火温度没有用过，本人习惯52-60度左右。本站有资料，下载自己看一下，设计引物稍微注意一下设计原则基本无碍。

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追求不惜，奋斗不息

4楼2015-10-27 08:16:38

hcf321283

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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你可以尝试使用touch down反应程序把你的退火温度包含进去。

5楼2015-10-27 09:35:15

天龙n部

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【答案】应助回帖

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其实，你做多了，这都不是问题，我都尝试过上游100度bp的引物，下游20度bp的引物还是可以很好P的。touch down PCR，巢式PCR等我个人认为是在模板高GC或者有高级结构时采用会比较好，其他普通PCR条件完全可以了，我引物退火温度从来不考虑，常年60度，简单模板从来没有出问题（5年经验）

最后祝好运吧

6楼2015-10-28 15:29:25