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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急！PMD19T为载体，转化用大肠杆菌DH5a，提出来的质粒长度还到2000bp
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牧神午后

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急！PMD19T为载体，转化用大肠杆菌DH5a，提出来的质粒长度还到2000bp 已有4人参与

最近在做定量PCR的实验，所以需要含有目的片段的质粒做标准曲线，然后问题就来了
我是以pMD19T为载体连接，目的片段长度是120bp，转化用大肠杆菌DH5a，挑取单克隆后做菌液PCR，是以M13-47和RV-M做为通用引物，扩增出的片段为250bp左右，测序也是对的，获得了阳性克隆，到这里都很正常；
之后我用相应的菌液质粒小提，提出来的质粒长度还到2000bp，要知道载体本身长2692bp，加上目的片段应该接近3000bp,反复提了几次都是2000的片段，以质粒为模板用目的基因的特异性引物扩增，反而能得到一条3000bp左右的模糊条带，但是并没有目标片段，这里值得一提的是我之前得到过3000bp的正确长度的质粒，特异引物也是正确的，因为这个基因的定量PCR我已经进行了一半了
求大神指点啊
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好吃，还能保持好身材的妹纸，才是会享受生活的妹纸
1楼 2015-10-23 10:16:01
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tolobio

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nono2009: 金币-10, 屏蔽内容, 违规存档, 禁止回帖广告 2015-10-25 10:00:05
本帖内容被屏蔽
2楼2015-10-23 11:09:07
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
牧神午后: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-10-26 09:52:21
是因为质粒超螺旋，电泳时候显得小了吧？
你试试单酶切质粒线性化，再电泳看看
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3楼2015-10-23 12:35:51
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牧神午后

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tolobio at 2015-10-23 11:09:07
应该是质粒重组了。做realtime的话，不需要克隆的吧。只要PCR产物来做，应该就可以了。需要的话，可以联系support@tolobio.com

是不需要克隆的，我只是做来看看有没有我想要的片段
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好吃，还能保持好身材的妹纸，才是会享受生活的妹纸
4楼2015-10-23 14:53:52
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牧神午后

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-10-23 12:35:51
是因为质粒超螺旋，电泳时候显得小了吧？
你试试单酶切质粒线性化，再电泳看看

之前我做过这个片段的连接转化提质粒并没有这种情况出现，所以就很奇怪，那超螺旋之后就不能用特异引物扩增出片段了吗

酶切成线性的能用来做定量吗
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好吃，还能保持好身材的妹纸，才是会享受生活的妹纸
5楼2015-10-23 14:58:46
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tolobio

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 牧神午后 at 2015-10-23 14:53:52
是不需要克隆的，我只是做来看看有没有我想要的片段...

好的。
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6楼2015-10-23 15:32:52
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品茗听雨0530

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
牧神午后: 金币+1, ★有帮助 2015-10-26 09:52:00
质粒长度不能通过跑电泳确定，环状质粒电泳条带偏低。
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7楼2015-10-25 22:05:06
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liping121200

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
牧神午后: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-10-26 09:51:46
应该是质粒超螺旋变小了，我建议你做个酶切看看，就用你目的基因两端的酶切位点做个双酶切，跑个电泳，如果能切下来你的目的片段，就证明片段是连接在载体上，这么做比较可信。
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好好学习，天天向上
8楼2015-10-26 08:55:29
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

以质粒为模板，P不出你的目的产物来，确实是很奇怪。难道你连上去的片段丢失了？质粒构建啥都有可能。你这个构建的质粒转大肠杆菌传了好几代了吗？你以前提出来的正确大小的质粒有没有保存？最好是做下测序验证一下，你的目的片段还在不在这个质粒上，以免耽误你下面的实验。
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9楼2015-10-27 16:55:49
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-26 08:55:29
应该是质粒超螺旋变小了，我建议你做个酶切看看，就用你目的基因两端的酶切位点做个双酶切，跑个电泳，如果能切下来你的目的片段，就证明片段是连接在载体上，这么做比较可信。

我的是连接的质粒酶切后目的片段大小正确，空载体变小了，求指点，谢谢
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10楼2015-12-30 10:57:42
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