应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急！PMD19T为载体，转化用大肠杆菌DH5a，提出来的质粒长度还到2000bp
101/1返回列表
查看: 5569  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

牧神午后

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急！PMD19T为载体，转化用大肠杆菌DH5a，提出来的质粒长度还到2000bp 已有4人参与

最近在做定量PCR的实验，所以需要含有目的片段的质粒做标准曲线，然后问题就来了
我是以pMD19T为载体连接，目的片段长度是120bp，转化用大肠杆菌DH5a，挑取单克隆后做菌液PCR，是以M13-47和RV-M做为通用引物，扩增出的片段为250bp左右，测序也是对的，获得了阳性克隆，到这里都很正常；
之后我用相应的菌液质粒小提，提出来的质粒长度还到2000bp，要知道载体本身长2692bp，加上目的片段应该接近3000bp,反复提了几次都是2000的片段，以质粒为模板用目的基因的特异性引物扩增，反而能得到一条3000bp左右的模糊条带，但是并没有目标片段，这里值得一提的是我之前得到过3000bp的正确长度的质粒，特异引物也是正确的，因为这个基因的定量PCR我已经进行了一半了
求大神指点啊
回复此楼

» 猜你喜欢
好吃，还能保持好身材的妹纸，才是会享受生活的妹纸
1楼 2015-10-23 10:16:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tolobio

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nono2009: 金币-10, 屏蔽内容, 违规存档, 禁止回帖广告 2015-10-25 10:00:05
本帖内容被屏蔽
2楼2015-10-23 11:09:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
牧神午后: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-10-26 09:52:21
是因为质粒超螺旋，电泳时候显得小了吧？
你试试单酶切质粒线性化，再电泳看看
赞一下 回复此楼
3楼2015-10-23 12:35:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧神午后

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tolobio at 2015-10-23 11:09:07
应该是质粒重组了。做realtime的话，不需要克隆的吧。只要PCR产物来做，应该就可以了。需要的话，可以联系support@tolobio.com

是不需要克隆的，我只是做来看看有没有我想要的片段
赞一下 回复此楼
好吃，还能保持好身材的妹纸，才是会享受生活的妹纸
4楼2015-10-23 14:53:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧神午后

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-10-23 12:35:51
是因为质粒超螺旋，电泳时候显得小了吧？
你试试单酶切质粒线性化，再电泳看看

之前我做过这个片段的连接转化提质粒并没有这种情况出现，所以就很奇怪，那超螺旋之后就不能用特异引物扩增出片段了吗

酶切成线性的能用来做定量吗
赞一下 回复此楼
好吃，还能保持好身材的妹纸，才是会享受生活的妹纸
5楼2015-10-23 14:58:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tolobio

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 牧神午后 at 2015-10-23 14:53:52
是不需要克隆的，我只是做来看看有没有我想要的片段...

好的。
回复此楼
6楼2015-10-23 15:32:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

品茗听雨0530

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
牧神午后: 金币+1, ★有帮助 2015-10-26 09:52:00
质粒长度不能通过跑电泳确定，环状质粒电泳条带偏低。
赞一下 回复此楼
7楼2015-10-25 22:05:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liping121200

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
牧神午后: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-10-26 09:51:46
应该是质粒超螺旋变小了，我建议你做个酶切看看，就用你目的基因两端的酶切位点做个双酶切，跑个电泳，如果能切下来你的目的片段，就证明片段是连接在载体上，这么做比较可信。
赞一下 回复此楼
好好学习，天天向上
8楼2015-10-26 08:55:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

以质粒为模板，P不出你的目的产物来，确实是很奇怪。难道你连上去的片段丢失了？质粒构建啥都有可能。你这个构建的质粒转大肠杆菌传了好几代了吗？你以前提出来的正确大小的质粒有没有保存？最好是做下测序验证一下，你的目的片段还在不在这个质粒上，以免耽误你下面的实验。
赞一下 回复此楼
9楼2015-10-27 16:55:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-26 08:55:29
应该是质粒超螺旋变小了，我建议你做个酶切看看，就用你目的基因两端的酶切位点做个双酶切，跑个电泳，如果能切下来你的目的片段，就证明片段是连接在载体上，这么做比较可信。

我的是连接的质粒酶切后目的片段大小正确，空载体变小了，求指点，谢谢
赞一下 回复此楼
10楼2015-12-30 10:57:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 牧神午后 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +3 布布和一二 2026-08-08 3/150 2026-08-08 18:15 by Lightingo
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:47 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 5/250 2026-08-08 16:27 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 6/300 2026-08-08 15:07 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 WQyTGMbfH7Cx 2026-08-07 4/200 2026-08-08 15:02 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 4/200 2026-08-08 14:27 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:22 by oEVWOejN9taj
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:07 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:01 by oEVWOejN9taj
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 6/300 2026-08-08 10:19 by 3OOjAIS77qg2
[基金申请] 基金中了 +14 laoda193707 2026-08-06 14/700 2026-08-08 00:23 by 实验小白ha
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭