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拟南芥根的半薄切片 已有2人参与
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做了几次半薄切片，细胞变形，并且有的破碎了。步骤如下，请问问题出现在哪里？谢谢 一、第一次固定 固定液：2%戊二醛溶液 +4%多聚甲醛 in 25mM CaCo buffer pH 7.2（最关健步骤） 室温15 min，固定时，应让材料沉底。 4度过夜 二、清洗 用25 mM CaCo buffer清洗4次，每次10min。 三、清洗 用水洗4次，每次10分钟（务必洗干净）。 四、梯度脱水 Dehydrate the samples by the following steps: 25% 丙酮 at RT for 30 min (x 1) 50%丙酮 at RT for 30 min (x 1) 75%丙酮 at RT for 30 min (x 1) 100%丙酮 at RT for 30 min (x 2) 五、渗透 Change the Spurr in the following steps: 25% Spurr in acetone at RT for 45 min 50% Spurr in acetone at RT for 45 min 75% Spurr in acetone at RT for 45 min 100% Spurr in acetone at RT for 45 min 100% Spurr in acetone overnight at 4oC 八、包埋 Change 100% Spurr in acetone once more, and then put the samples into beemcapsules and then incubate at RT for 4 h. Then imbedding the beemcapsules for 16 hours at 70 度。 九、切片 玻璃刀切 十、复染 亚甲基蓝染色,洗脱三次 CaCO Buffer配方： 包埋剂的配比：10 g VCD(ERL), 6 g DER, 26 g NSA，轻轻搅拌至均匀，加0.4 g DMAE，再次搅拌均匀。（注意防水，不宜长期存放） |
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【答案】应助回帖
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切破最直接的原因是有水，说明脱水不干净，建议增加丙酮梯度脱水为30，50，75，85，90，95，100，100，同时所有步骤进行时，尽量在有抽湿机环境下，湿度低于30%。另外，spurr切片不应该有一步锇酸固定吗？ 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-10-29 19:58:45
送红花一朵 |
我其实是做半薄切片，没用电镜看超微结构，我还有一个问题就是细胞变形，这也跟脱水梯度和时间有关系吗？我有一个染gus的幼苗，因为要用70%的乙醇洗脱叶绿素，所以我想用FAA固定，然后用乙醇脱水，再用spur可以吗？ 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2015-10-30 00:06:51
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1.我们无论是半薄还是超薄，都需要锇酸固定，戊二醛至多算是预固定 2.细胞变形的原因比破裂复杂，无锇酸，脱水太快，刀口锋利程度，等等，都需要注意 3.理论上说，只要能与spurr和水互溶的试剂均可以用来脱水，但需要考虑乙醇的脱水效果不如丙酮 发自小木虫Android客户端 |
4楼2015-10-30 06:01:02
champion555 
捐助贵宾 (正式写手)
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- 专业: 细胞、亚细胞结构与功能
5楼2015-10-30 08:28:38
【答案】应助回帖
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一般做拟南芥根形态学观察遇到的问题都是细胞收缩。楼主遇到细胞破碎的问题我个人观点可能有两个原因。 1.漂洗脱水等条件不恰当，就象前面有虫友说脱水梯度安排的过大不够温和是一方面，我想更主要的是漂洗缓冲液渗透压过低，造成细胞在漂洗时不停从环境中吸水而涨破了。一般动物样品用生理盐水浓度 90mM，根遇到的环境含水更多因此渗透压还要再低一些60-80mM。 2.样品取材太大，固定剂渗透不完全，造成样品块中间的细胞固定不完全，也会导致切片破碎的。 楼主可以用关键词“同济大学，祝建，拟南芥根”搜索，祝老师团队是国内利用显微镜研究拟南芥根的权威之一，他们的protocol应该比较有参考价值 |
6楼2015-10-30 14:41:13
7楼2015-10-30 14:44:17
8楼2015-10-30 17:01:42
9楼2015-10-30 17:02:53
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