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跪求！克隆基因启动子，用HI-TAILPCR测序多次结果都是非目的条带，请教各位大神原因！
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先克隆了该基因的cDNA获得全长，然后克隆了该基因内含子，就中间不到200bp一段，跟拟南芥该基因一样，然后根据内含子前面500bp设计反向互补引物3条，间隔100左右，根据文章中要求，后两条计算后TM值均在68℃以上，tail的体系程序完全用的都是文章中的，引物是英潍捷基（上海）合成的，酶用的是诠释金的高保真的Pfu酶。克隆1年了，先前用的是武汉的FPNI-PCR方法，跟HI-TAIL原理类似，结果也都是非特异性条带，然后用HI-TAIL，结果也是非特异，想问下各位大神到底是哪里的问题！本人也是着急毕业啊！！跪谢！！！ （附：图片3个为一组，分别是2轮产物，3轮产物，和3轮普通PCR结果，选了红框里大于1000的条带，测序结果，还是非目的性条带。） 本人新虫，攒了两天，一共只能拿出7个金币，对不住大家了！！  每3个一组，分别是2轮，3轮，和普通pcr3轮 |
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3楼2016-04-19 15:53:24
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如果选择条带，测序，选择第三轮产物比第二轮的小的去测序。确定三条特异引物没问题？takara的ex酶效率高些，好多tail-pcr文章都提到这个酶。稀释倍数建议50倍 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-10-30 13:09:32
4楼2016-04-19 15:53:44