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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pGreen系列载体转化农杆菌出现问题
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我是传奇456

金虫 (正式写手)

[求助] pGreen系列载体转化农杆菌出现问题 已有1人参与

具体情况是，pGreenII 62-SK系列载体，Kana抗性。将目的基因构建重组质粒后，在kana抗性LB中筛选阳性克隆，测序结果正确，然后进行农杆菌热激转化（质粒加入约1ug），涂在含Rif（10ug/ml）Kana(50ug/ml)的LB平板。48h后仅长了寥寥数个菌落，而control组pcambia2301长了很多。另外，目的载体同时还涂布了只含Kana(50ug/ml)的LB平板，也长了几十个菌落。

我想请问下，这种情况是为什么？是否是pGreen质粒本身问题？还是转化过程中质粒出现了问题？

试了好几次，包括质粒浓度，Rif浓度的控制等，而长的仅有的几个菌落挑了摇培后，PCR也测不到目的片段。

还请各位大侠帮忙！！

另附载体图谱

pGreen系列载体转化农杆菌出现问题
pGreenII 62-SK.png
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1楼 2015-10-15 10:30:07
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我是传奇456: 金币+5, ★有帮助, 不行的话只能试试电转了。 2015-10-16 22:06:42
.建议 做电转化看看，农杆菌化学感受态转化效率低
农杆菌菌检建议弄个100ul菌液离心后用100ul水混匀在金属浴或者PCR仪器上80-90度10min后再去做PCR
赞一下 回复此楼
。
2楼2015-10-15 10:55:05
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
3楼2015-10-15 11:20:08
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
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