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七色锦

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助钙转慢病毒包装与转染经验 已有1人参与

各位大神帮帮忙我正在做慢病毒包装,求经验,我用的是三质粒系统,怎样提高慢病毒的包装效率?谢谢了
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七色锦

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-15 01:29:26
http://www.dxy.cn/bbs/topic/31028202去我帖子里看。有问题站短我。

谢谢你啊,,你用的是10ml体系的我用的是小皿,4ml体系,实验室师兄做逆病毒转染,转染效率很高,老师给我的protocol,跟他的那个差不多,所以我的一些操作也类似,用的试剂盒也是钙转的,好像是国外的试剂盒,我的三个质粒也是老师给我的,pCMV-dR8.2,VSV-G还有一个目的质粒,我抽提的质粒目的质粒864ng,dr是432,vsv是890 ,我想问一下这三个质粒加入各加入多少呀,转染的时候加了喹啉,换液是12小时换一下,再过大概12小时换一下,培养液是2ml然后再24小时后收病毒放在4度冰箱,重新加入2ml培养24小时后再收病毒,把这个病毒跟前天收的病毒一起离心1500转,用它直接转染目的细胞了,因为我转染的是白血病细胞,转染效率能在10%之上,我就可以把它sorting出来了,我的问题是我本身的病毒包装效率不能达到70%上所以我的目的细胞转染率就很低了,我是实验小白啦,希望大神多多帮助我,第一次在小木虫上发帖求助,不知道怎么弄的,看到有人回复我,我还是挺开心的
3楼2015-10-15 10:10:30
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
http://www.dxy.cn/bbs/topic/31028202去我帖子里看。有问题站短我。
2楼2015-10-15 01:29:26
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 七色锦 at 2015-10-15 10:10:30
谢谢你啊,,你用的是10ml体系的我用的是小皿,4ml体系,实验室师兄做逆病毒转染,转染效率很高,老师给我的protocol,跟他的那个差不多,所以我的一些操作也类似,用的试剂盒也是钙转的,好像是国外的试剂盒,我 ...

摸摸头,你加我151354061咱俩慢慢详细说。。。
话说,载体:dr:vsvg=4:3:1,总量你按照我之前的protocol换算一下。我转然前2h加CQ,转然后12h换液,在之后不换液了,48h收一次,再24h收一次,中间可以4度保存。当然,更好的办法是只收一次,收了就浓缩,然后直接感染。
转然后换液的时候最好加15mM的Hepes(我记得好像是这样,你再查查浓度)。
另外,转白血病细胞的话,好像带MSCV的病毒载体比较好。最好超速离心一下浓缩。
包慢病毒,我用lentiX293T细胞,效果比普通293T或者FT效果好很多。
4楼2015-10-16 01:17:30
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

转染的话在对数生长期进行,这个时期细胞最易吸收外源质粒,但是不同细胞有所差异。看要怎么转染吧,如果是稳转细胞筛选,转染效率15%就够了,提高转染效率的话,可以适当降低转染时细胞的密度(60~70%的密度比90%好一些),另外还有可能就是细胞的生长状态,还有在接种后24h内进行转染。
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-11-13 16:44:37
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