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981737348新虫 (初入文坛)
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[求助]
真核表达载体构建成功但是不表达目的蛋白，大家帮忙分析一下原因谢谢！ 已有2人参与
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请教一下表达载体构建的问题。。 我构建了4个真核表达载体分别为pcDNA3.1His/myc(+)，pEGFPN1,3xflag-cmv及pccDNA3,1-ZEO，要表达的目的蛋白为（序列1332bp大小），51kD大小的膜蛋白，载体构建测序正确，以空载体作为对照，脂质体2000转染293以及cos7细胞western blot结果都显示不表达，空载GFP 显示转染效率90%。现在非常郁闷，不知道问题出自哪里。希望大家帮助分析一下。谢谢！ |
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981737348
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4楼2015-10-22 08:59:58
【答案】应助回帖
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一般的话，原因答题是可以分为两种： ①不表达，从基因上开始分析，无论是用那种宿主表达蛋白，真核表达或是原核表达，都要考虑到基因优化的层面，如果基因本身不适在此系统中表达，那么下游在怎么优化也是不表达的 ②表达条件的优化，转染效率是否转染成功，细胞培养细胞生长的状态，这些条件是可以通过自己优化解决的 此外，真核细胞蛋白表达，载体的选择是很重要的，因为利用哺乳动物细胞表达蛋白，你是用的是瞬时转染表达技术，瞬转效率本身也不高，1mg的质粒摇1l也就能得到1mg左右的蛋白，所以载体的选择很关键，我们就有一个自己的高表达载体 你这个情况我估计是序列本身就应该要优化吧，考虑到密码子的简并性， |
2楼2015-10-14 15:54:08
981737348
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3楼2015-10-14 18:04:16
5楼2015-10-23 16:43:05