| 查看: 3470 | 回复: 7 | |||
981737348新虫 (初入文坛)
|
[求助]
真核表达载体构建成功但是不表达目的蛋白，大家帮忙分析一下原因谢谢！ 已有2人参与
|
|
请教一下表达载体构建的问题。。 我构建了4个真核表达载体分别为pcDNA3.1His/myc(+)，pEGFPN1,3xflag-cmv及pccDNA3,1-ZEO，要表达的目的蛋白为（序列1332bp大小），51kD大小的膜蛋白，载体构建测序正确，以空载体作为对照，脂质体2000转染293以及cos7细胞western blot结果都显示不表达，空载GFP 显示转染效率90%。现在非常郁闷，不知道问题出自哪里。希望大家帮助分析一下。谢谢！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【资源-分享】 |
» 猜你喜欢
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有137人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
981737348: 金币+1, ★有帮助 2015-10-15 20:06:16
感谢参与，应助指数 +1
981737348: 金币+1, ★有帮助 2015-10-15 20:06:16
|
一般的话，原因答题是可以分为两种： ①不表达，从基因上开始分析，无论是用那种宿主表达蛋白，真核表达或是原核表达，都要考虑到基因优化的层面，如果基因本身不适在此系统中表达，那么下游在怎么优化也是不表达的 ②表达条件的优化，转染效率是否转染成功，细胞培养细胞生长的状态，这些条件是可以通过自己优化解决的 此外，真核细胞蛋白表达，载体的选择是很重要的，因为利用哺乳动物细胞表达蛋白，你是用的是瞬时转染表达技术，瞬转效率本身也不高，1mg的质粒摇1l也就能得到1mg左右的蛋白，所以载体的选择很关键，我们就有一个自己的高表达载体 你这个情况我估计是序列本身就应该要优化吧，考虑到密码子的简并性， |
2楼2015-10-14 15:54:08
981737348
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 772.2
- 帖子: 17
- 在线: 7.1小时
- 虫号: 1662970
- 注册: 2012-03-04
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2015-10-14 18:04:16
981737348
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 772.2
- 帖子: 17
- 在线: 7.1小时
- 虫号: 1662970
- 注册: 2012-03-04
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2015-10-22 08:59:58
5楼2015-10-23 16:43:05
981737348
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 772.2
- 帖子: 17
- 在线: 7.1小时
- 虫号: 1662970
- 注册: 2012-03-04
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
6楼2015-10-25 12:00:34
981737348
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 772.2
- 帖子: 17
- 在线: 7.1小时
- 虫号: 1662970
- 注册: 2012-03-04
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
7楼2015-10-25 12:01:19
8楼2015-10-26 11:12:56