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Western Blot科普贴 已有4人参与
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蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是将电泳分离后的细胞或组织蛋白质从凝胶转移到固相支持物例如硝化纤维（NC）或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，然后通过特异性抗体对样品进行着色。根据分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。这种方法现在已经广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断（例如：HIV）等多个方面。 蛋白质印迹法繁琐复杂，每一个步骤都有很多需要注意的操作。只有小心翼翼做好每一步，才能保证最终实验的成功。顺利跑完电泳后，印迹法的第一步是转渍，也是重要的开端。因为每个人的目标蛋白不同，所以没有统一的转渍protocol让大家使用。转渍的方法选择、实验条件和时间是需要通过实际经验来不断摸索和总结的。那么到底怎样才能确定蛋白质被完整转移了呢？小编今儿就给大家讲解下转渍过程中一些小技巧，不但可以检测转渍效率，也可以让大家在实验上少走不必要的弯路。 1. 蛋白分子量标准的完整转移 一定要使用提前染色的蛋白质标记 （Pre-stained Protein Marker）来监测蛋白质样品的转移。虽然样品中的蛋白质是看不见的，但是如果染色很明显的标准被成功转移到膜上的话，意味着大部分的样品也同样被转移了。有时虽然分子量很大的蛋白质标记没有被转移，大家爷不必太担心，因为目标蛋白一般都比最大的标记分子量小很多，应该是被成功转移了的。其实更值得注意的是转渍时间不宜过长，否则分子量很小（小于20kDa）的蛋白有可能已经从膜的孔隙穿过，附着在滤纸上了。还有一点就是，如果你想在转渍的过程中观察标记转移程度的话，这个小动作很容易引入气泡，影响转渍效率。所以小编建议大家使用不是很重要的样品提前做好优化实验，确定转渍条件和时间，再进行真正的转渍。 2. 转渍后，把SDS-PAGE的凝胶染色 第二个监测转渍效率的方法就是将凝胶染色，例如Coomassie Stain。这个方法简单、便捷，可以清晰地显现出凝胶上的蛋白质含量，从而判断转渍效率。如果凝胶基本上是透明、干净的，那么转渍很成功；如果凝胶上还有很多蛋白质条带，证明需要增加转渍时间。小编在这里提醒一下大家，如果这么做了的话，即使有很多蛋白还在凝胶上，也不能继续转移到膜上了，因为染色是不可逆的。所以还是建议大家用不是很重要的样品提前做好优化实验，确定转渍条件和时间，再进行真正的转渍。 3. 对膜进行染色 第二条建议虽然好，但毕竟凝胶染色是不可逆的，会影响实验进度和效率。另外一条建议就是将膜染色。有很多kit是可以成功将膜染色，肉眼就可以辨别出蛋白质的位置，而在短短几分钟内又可以完全将染料去除掉，大家可以放心的进行接下来的实验。这样一来，就可以很好的检测到底有多少蛋白质被转移到膜上。这个方法也会让大家在做接下来的实验时更加有自信。 4. 转渍在两张膜上 上面的方法都是可以鉴定转渍的时间是否太短。如果大家想检测转渍时间是否设定的过长，就可以尝试着放两张膜，然后进行规范的转渍实验。如果转渍条件合适，那么大部分的蛋白质是应该在离凝胶最近的那张膜上；反之，在另外一张膜上也会检测到不少蛋白。如果你的目标蛋白的分子量很小，那尤其需要注意。蛋白质分子量越小，转渍需要的时长越短。如果在一张膜上找不到目标蛋白，那很有可能已经转移到第二张膜上了！ 总结来看，小编建议大家要依据自己目标蛋白的特点来提前优化转渍条件。成功转渍也算是开启蛋白质印迹法成功大门的第一把钥匙啦！ 文章来源 http://mp.weixin.qq.com/s?__biz= ... isappinstalled=0#rd 发自小木虫IOS客户端 |
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 蛋白表达纯化与检测 | 科研之家（食品） |
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2楼2015-11-05 11:07:18
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这个主要取决于你的转渍方法（wet transfer/semi-dry transfer) 和膜孔隙的大小。孔隙越大，转渍时间就应该越小。 举个例子，我通常使用semi-dry transfer， 实验室里给的standard protocol是转膜一小时。 但是由于我的目标蛋白相对较小 20kDa, 我适当减少到了40-30分钟，膜孔隙 0.45 和 0.2 微米都试过，转渍效率没有太大差别，几乎都能做到complete transfer。 如果你的蛋白在50kDa的话，那么使用0.45微米的膜就可以，semi-dry transfer转渍一小时左右差不多。wet transfer我做的不多，没有办法给你太多建议。 但是无论如何，你都要自己做一些优化实验，来找到合适的转渍条件。 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2015-11-05 20:21:45
4楼2015-11-05 22:52:44
5楼2015-11-07 00:10:08
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6楼2015-11-07 17:30:09
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7楼2015-11-22 22:49:23
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