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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于两个基因如何共表达的问题！求赐教！⊙﹏⊙
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1993zx

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于两个基因如何共表达的问题！求赐教！⊙﹏⊙ 已有3人参与

嗯，首先呢，我是研一狗，目前处于查文献写开题中，理论思路是这样的，用腺病毒载体共表达两个基因，在第一个目的基因已经插入的情况下，如何表达第二个基因(当佐剂的细胞因子)?我有看到文献是通过同源重组，把线性化后的质粒与回收的第二个基因通过EZ重组试剂盒连接，可行吗?还有没有其他方法，谢谢！

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1楼 2015-09-23 12:59:57
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-23 22:47:03
你就是要用腺病毒载体表达两个基因？是什么基因？表达蛋白的？
这事还不简单，你要么通过IRES带上第二个基因的CDS（效率低一点），或者另起，找个空白地方装入另一个promoter-GOI-polyA signal。
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2楼2015-09-23 13:58:20
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1993zx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-23 13:58:20
你就是要用腺病毒载体表达两个基因？是什么基因？表达蛋白的？
这事还不简单，你要么通过IRES带上第二个基因的CDS（效率低一点），或者另起，找个空白地方装入另一个promoter-GOI-polyA signal。

嗯，其中一个是病毒的结构蛋白，另外一个是动物的细胞因子,用来增强免疫原性的，那如果IRES表达效率低的话，有没有什么方法改进啊，谢谢

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3楼2015-09-23 14:22:01
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lchxs465

禁虫 (初入文坛)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-23 22:47:23
本帖内容被屏蔽
4楼2015-09-23 17:21:04
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1993zx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lchxs465 at 2015-09-23 17:21:04
可以质粒共转化啊，用两个不同的质粒（注意复制子要不同）分别插入两个基因，共转化到一个细胞中立刻，这样比较方便

比如另外一个基因插入普通真核质粒?pVAX?

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5楼2015-09-23 17:52:27
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by lchxs465 at 2015-09-23 17:21:04
可以质粒共转化啊，用两个不同的质粒（注意复制子要不同）分别插入两个基因，共转化到一个细胞中立刻，这样比较方便

他是在整腺病毒，是在转染或者感染！
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6楼2015-09-23 21:36:17
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飞奔的大象

新虫 (小有名气)
建议另做框架，选好启动子，2型和3型，是不是加终止信号。

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7楼2015-09-23 23:22:12
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如1楼同志所说，可以使用以下方法之一：
1、使用IRES序列，即在第一个基因的终止密码子之后polyA之前插入IRES序列及第二个基因完整的CDS即可；
2、使用2A序列，即在第一个基因的的终止密码子之前插入2A序列并插入第二个基因的完整CDS，期间注意读码框正确；
3、增加完整表达框，即在第一个基因的polyA之后，插入启动子-基因2-polyA结构（可以是从别的质粒上直接扒下来）。

增加的方法推荐同源重组法，简单快捷粗暴有效。。或者你喜欢普通的酶切-连接法也可以。
金币交出来。。
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8楼2015-09-24 01:11:21
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1993zx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-24 01:11:21
如1楼同志所说，可以使用以下方法之一：
1、使用IRES序列，即在第一个基因的终止密码子之后polyA之前插入IRES序列及第二个基因完整的CDS即可；
2、使用2A序列，即在第一个基因的的终止密码子之前插入2A序列并插入 ...

同源重组就线性化质粒，用试剂盒直接和另外基因连接吗?

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9楼2015-09-24 10:34:13
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 1993zx at 2015-09-24 10:34:13
同源重组就线性化质粒，用试剂盒直接和另外基因连接吗?
...

是，只是你PCR设计引物的时候两端带上20bp左右的同源臂。详见说明书，随便搜一家的“无缝克隆”。
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10楼2015-09-24 13:45:48
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