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liyueyue

铁虫 (正式写手)

[交流] 配了一个PCR mix,当天有结果,放-20度几天之后,不能用了?

最近PCR遇到一个奇怪的问题,哪位帮我分析一下,不胜感激:
因为每次PCR都要用到5*PCR buffer, 25mM MgCl2和10mM dNTP,所以配了一个400倍反应体系的mix,当天配完后,这个mix是好用的。然后我就把它存放在冰箱了(这个mix中没放taq酶)。可是几天后,用相同的模板,PCR仪,PCR程序,扩了40多个样本,结果只有一个样本有条带。我感觉PCR buffer, MgCl2和dNTP这三个混到一起不容易出问题,完全可以配个mix储存起来。是哪里出问题了啊?
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renzhiq

木虫 (小有名气)

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liyueyue: 金币+5 2016-01-15 12:39:47
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2015-09-23 04:05:16
400倍,可能吗?配好放2-8度。

他应该想表达的是400倍反应体积,50ul*400

发自小木虫Android客户端
8楼2015-09-23 07:46:30
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xiaoyanzi517

铜虫 (小有名气)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
liyueyue: 金币+10 2016-01-15 12:38:47
我配1x,放-20℃,一个月都没问题。
应该不是其中某一个试剂的原因,因为有一个样本扩出来了。
推测:1.是否是配置后液体不均匀,或者复融后没有振荡混匀所致。2.是否是DNA有问题?3.如果某些不好扩增的序列,或者引物不好,现配的mix效率更高
偶时晴天偶时雨
13楼2015-09-23 23:17:27
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普通回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-22 22:15:17
liyueyue: 金币+5 2016-01-15 12:39:13
估计是dNTP失效了,dNTP在低浓度时易失效,反复冻融会加速该过程。
2楼2015-09-22 20:40:15
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3楼2015-09-22 21:17:21
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547star

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
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liyueyue: 金币+5 2016-01-15 12:39:26
400倍,可能吗?配好放2-8度。
为什么
4楼2015-09-23 04:05:16
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阿Q~~

至尊木虫 (文坛精英)

路过的看了一下,帮顶,祝福你好运!~~~~~~~~~~~~~~~~~~
自强不息,厚德载物;独立精神,自由思想。
5楼2015-09-23 06:55:47
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
专业做mix的技术,路过,笑而不语

发自小木虫Android客户端
6楼2015-09-23 06:59:11
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renzhiq

木虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★ ★
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liyueyue: 金币+5 2016-01-15 12:39:42
你这个现象确实有点奇怪,如果说某种成分变了,应该所有的都扩增不出来,可你又有一个扩增出来了。奇怪……
我以前也会自己配mix,并且我从来都是把Taq酶也加进去的,但从来没有遇到过这种情况。
请问你储存在4℃还是-20℃?我存放在4℃,如果说你存放在-20℃,有不有可能是没有完全融化?导致这种结果?

发自小木虫Android客户端
7楼2015-09-23 07:42:32
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asked6188

木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★ ★ ★
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liyueyue: 金币+5 2016-01-15 12:39:51
反复冻融dNTP会降解
9楼2015-09-23 08:40:32
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
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liyueyue: 金币+5 2016-01-15 12:39:55
我连酶都是放在四度的 放个半年一年都可以用 没问题的

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2015-09-23 21:12:35
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