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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提土壤总DNA 的问题，郁闷了。。。
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crjtina

银虫 (小有名气)

[求助] 提土壤总DNA 的问题，郁闷了。。。 已有2人参与

之前用的国产的试剂盒提总DNA，浓度和纯度都不高，后来PCR后有条带，只不过二聚体有点严重，想着换成进口的试剂盒用的是MP Fast的提土壤总DNA，结果没P出来条带，好郁闷，Marker跑的也不是很好，试剂盒里的BBS溶液好像比我用的Loading buffer效果要好，现在是自己摸索的各种阶段，郁闷啊。。。。。。
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赠人玫瑰，手有余香。
1楼 2015-09-17 17:13:19
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爱睡猪

金虫 (正式写手)
前处理清洗和除大颗粒要做好，我们用CTAB和试剂盒方法都提过，还可以
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ControlMyself
2楼2015-09-18 08:46:54
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2015-09-18 08:46:54
前处理清洗和除大颗粒要做好，我们用CTAB和试剂盒方法都提过，还可以

提的是新鲜的泥状，如何前处理啊，主要想保留其微生物菌类的多样性，没做前处理
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赠人玫瑰，手有余香。
3楼2015-09-18 09:02:09
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酒家何处

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crjtina: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-09-18 13:59:00
把土用pbs或者超纯水震荡。或者家玻璃珠震荡。多震荡一会。然后低速离心。取上清。微生物都在水里。下面的东西就都扔了。怕有丢的，再洗涤两次。合并上清。然后上清高速离心上清。时间可以长一些。弃上清，留沉淀。然后再用试剂盒处理这个沉淀。低速1000以下。高速10000以上

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4楼2015-09-18 09:14:53
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酒家何处

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 酒家何处 at 2015-09-18 09:14:53
把土用pbs或者超纯水震荡。或者家玻璃珠震荡。多震荡一会。然后低速离心。取上清。微生物都在水里。下面的东西就都扔了。怕有丢的，再洗涤两次。合并上清。然后上清高速离心上清。时间可以长一些。弃上清，留沉淀。 ...

低速还是更低点吧 。能把土沉下去就好了

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5楼2015-09-18 09:18:58
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 酒家何处 at 2015-09-18 09:14:53
把土用pbs或者超纯水震荡。或者家玻璃珠震荡。多震荡一会。然后低速离心。取上清。微生物都在水里。下面的东西就都扔了。怕有丢的，再洗涤两次。合并上清。然后上清高速离心上清。时间可以长一些。弃上清，留沉淀。 ...

嗯，嗯，回头我试试，但我觉得PCR也是有问题的，我参考了之前的文献，反应条件没变，反应体系调整到25 ul，10*taq buffer:2.5ul,dDNT:0.5;Mgcl2:2.5,引物各1.5，模板2 ul,Taq酶:0.5
反应条件：94预变性5min，94:1min,55°退火，72°延伸，38循环，72°延伸2min
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赠人玫瑰，手有余香。
6楼2015-09-18 13:58:44
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by 酒家何处 at 2015-09-18 09:18:58
低速还是更低点吧 。能把土沉下去就好了
...

丢失的部分就让他丢掉吧，影响你提取的质量比你丢掉的那部分的影响还要大，做菌群分析PCR循环建议不要超过28，一般22-25就行了，循环越大越不准
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ControlMyself
7楼2015-09-19 12:17:46
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