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急急急：HPLC使用前中后相关问题请教，谢谢已有4人参与
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急急急向各大神求助： 我现在利用HPLC测面粉中的维生素B1、B2、B6和B9的含量，第一次接触HPLC有几个问题求教大神们： 1、测定的标准曲线单位是μg/ml，但最终论文中出现的应是μg/g，想问下这该怎么换算呢？文章中也没有提及如何换算，该怎么处理才好呢？ 2、测定维生素B6时需要使用离子对试剂（庚烷磺酸钠），测定维生素B9时需要使用离子对试剂（四丁基磷酸二氢铵），我的柱子是新柱子，请问使用离子对试剂是否对柱子有伤害？应该如何减少对柱子的损伤？在使用了离子对试剂的缓冲液与甲醇做流动相后，是否不能再使用该柱子测定不含离子对作为流动相的物质么？每次使用完后应该如何冲洗，冲洗多长时间才能确保将离子对冲出去？ 3、测定维生素B9时，需要用SPE进行萃取，我的SPE柱子是HYPERSEP C18 500MG/3ml 的，这个可以重复使用么？我查询了下说萃取分为四部：柱的活化和平衡、上样、冲洗和洗脱感兴趣的化合物，冲样是用一种强得能洗脱杂质而又弱得能保留感兴趣的化合物的冲洗液来冲洗杂质；洗脱是用溶剂将被吸附在萃取柱上的化合物洗脱在溶液里，也就是说上样后得到的液体和冲样得到的液体要丢弃掉，洗脱的液体留下是吧？ 如果大神们看到我的提问，求回复指导下，谢谢众大神。 [ Last edited by archbishop on 2015-9-16 at 20:59 ] |
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荧光杂峰问题！急急急，头大
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archbishop: 金币+1 2015-09-16 23:19:52
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1. 一般情况下 都会用ug/ml 为什么非要用 ug/g 2. 我分析用很多离子对， 一般用水相慢慢把离子对换出来。比如你的流动相是 离子对缓冲：甲醇（60:40）。 做完实验后慢慢换成 水：甲醇 60:40。 然后进行一般的柱子日常维护， 比如10%或20% 甲醇冲洗。 3. 一般不重复使用，a) 面粉中的大分子可能被吸附在柱子上很难洗脱，影响柱效。b）下一次洗脱B6中可能会引入杂质。 一般用TLC 检测是否目标化合物是否洗脱出来（洗脱顺序可以先用TLC 估量一下）。然后收集洗脱液，合并旋蒸。 |
3楼2015-09-16 22:34:13
xmin828
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archbishop: 金币+1 2015-09-17 11:02:22
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1、一般我们标曲直接使用μg/ml，如果你真要跟最终论文单位一致，可以查询下液体密度换算，一般μg/g我们是用在固体上的。 2、离子对试剂对柱子还是有一定的损伤，这个是公认的，没啥找较少损伤，最多你离子对试剂的量少些。所以一般我们实验室拿一根柱子做过离子对色谱法后，这根柱子就只用于离子对色谱法，不再它用。但是离子对色谱法确实非常好用，就是可惜的是柱平衡时间也较长。冲洗的话和正常C18柱冲洗一样，就是每一步冲洗时间延长一倍即可。 3、答：一般固相萃取小柱是不可重复使用的，但因为SPE柱子造价不低，所以之前方法摸索的时候我倒是有重复使用，但这不是正确做法。确实是取洗脱液。 |
6楼2015-09-17 09:15:59
xmin828
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archbishop: 金币+2, 感谢应助。 2015-09-17 13:12:09
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额……你说的好混乱，我除了最后一个问题基本都没太明白你的意思，第一个问题你最好能用公式表达一下，第二个问题你最好能把你文献原文放上来给我们看下 1.ppm这个单位非常吊诡，它可以是m/m，也可以是m/v，还可以是v/v 按照我对你这个问题的理解：你是要测面粉里的一个有关物质是么？假设为有关物质A，你做标曲时应该是面粉和溶剂取的一个固定量，假设取的面粉为1g，溶剂为50mL，然后你的有关物质A应该也是固体吧？在建立标曲时，实际上比较的是m(杂质A)/m(面粉)，所以单位为ug/g，这个量是不会随你溶剂的量而改变 2.你的离子对试剂没有买错，只是sigma有不同级别的罢了，只要CAS号正确就没问题，你看你右边那个quality designations描述，是可以用于离子对色谱法的。一般我们实验室离子对试剂10mM或者20mM就足够了的，你可以尝试从5mM开始摸索，5,10,20这么上升上去，一般不需要上到20mM以上，反正离子对试剂量越小越好就对了 3.SPE不是拿注射器推啊，它有个专门的固相萃取仪，你把SPE小柱放到那玩意上，保持密闭环境，在SPE小柱上加液，抽真空，液体会自动留下来。你百度下吧，我觉得这个应该有教学视频 |
9楼2015-09-17 12:51:35
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后两个不做不太了解，第一个做过类似的，以我们的实验为例，说说这个。 称量1g原料，溶入25ml溶剂抽提，过滤膜后取其中28ml，减压回收至结晶，加2ml甲醇溶解，进样量20ul。则进样的20微来自的原料的当量为： 1000mg÷25ml*20ml÷2000ul*20ul＝8mg 此时如果根据峰面积与标曲算出目标化合物的含量，假设为0.08mg。那么含量就是0.08/8，也就是1％了。 至于浓度什么的，只是在参考制样方法的时候会有，比如做中药参考药典一样。 发自小木虫Android客户端 |
19楼2015-09-18 09:29:57
2楼2015-09-16 22:19:40
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archbishop: 金币+2 2015-09-17 16:19:51
archbishop: 金币+2 2015-09-17 16:19:51
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先来句题外话：姑娘字不错啊~ 好，下面切入正题啊： 1、你这个公式仔细琢磨是不对的。如果你对杂质B是以浓度单位表示，那么你的待测固体A其实也以浓度表示了，还是假设你称样量为m，整个溶剂体积为V，那么你的待测固体A浓度实际为m/V，你进样量是不会影响杂质B与待测固体A之间的质量比的。因为它们在同一个溶剂体系下。 我不知道你那个待测固体A里面有没有杂质B，假设没有啊。那么这个标曲要怎么建立呢？假设你的杂质B限度值（100%）为10 ppm，那么这个标曲范围大概就是从5 ppm~15 ppm，也就是说如果你称1 g待测固体A（这个质量要固定），不管你用10、25还是50mL溶剂去溶解，你要加入的杂质B量就是从5 ug~15 ug，杂质B浓度会因体积改变而不同，但杂质B与待测固体A之间的质量比一直是固定的 2、你这个色谱条件有啊：The mobile phase was composed of 24% methanol (v/v) in aqueous potassium phosphate buffer(3.5 mM KH2PO4 and 3.2 mM K2HPHO4), pH 6.8, containing 5 mM tetrabutylammonium dihydrogen phosphate(Sigma) as an ion-pairing agent.简单说就是甲醇：缓冲盐水溶液（24:76），缓冲盐水溶液为3.5 mM KH2PO4 and 3.2 mM K2HPHO4，调pH为6.8，并且含有5mM四丁基磷酸铵（离子对试剂） |
12楼2015-09-17 16:07:23
14楼2015-09-17 21:27:42
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大神， 1、因为我的原材料是面粉，所以用Ppm的单位。我是想根据标准曲线找到浓度乘以进样体积，得到进样体积的质量，再根据比例看提取到了多少溶液换算的，我也不知道对不对。 2、那看到文献中说缓冲液中有少量离子对试剂，这个少量如何界定？我使用的是庚烷磺酸钠，但发现应该从sigma购买如图一左边的我买成了右边类型的，不知该怎么办 3、Spe是不是用针管来加压就可以呢，那个流速通过针管控制加样来控制呢 鞋过大神 期待你的回复  发自小木虫IOS客户端 |
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