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olivelmint

[交流] 关于真菌菌丝DNA的提取方法!

大家好,小弟最近遇到一个提DNA的问题!我参见的是国外的一篇文献的方法:采取的冻融的方法。

1 刮取菌丝,悬浮于装有100微升无菌水微试管中;

2 -70°超低温冰箱冷冻3分钟(文献上是干冰上冻3分钟)

3 100°水浴融化,涡旋2分钟(文献上是75°融化)

4 重复3次冻融循环,最后一次融化时间15分钟

5 15700转下,离心5分钟

6 吸取6.25微升上清作PCR模板

结果是:我做了3次试验,可是电泳的结果是没有目标条带出现,之前用别的方法提取DNA,条带可以看见,不知道为什么用文献上的方法就是提取不出来呢?

由于第一步从平板上刮菌丝会携带一部分琼脂,所以在第一步结束厚我先是用沸水煮了一下,然后转了一个微试管,目的是避免琼脂最后的干扰

高手们,帮我看看我是哪出了问题?关键是目前不知道这种方法DNA有没有提取出来!按理说,文献上的方法应该是可行的啊?谢谢指点!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
xyklmu(金币+4,VIP+0):感谢答复,两个帖子一起评了
1、不要vortex,DNA严重断裂。就算要vortex也不要超过5s
2、离心时要4℃离心

为什么不用经典的酚-氯仿法抽提呢?
2楼2008-08-29 15:09:18
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

另外这个转速会不会太高了……不知道上清里头会不会有DNA哦
100℃的水浴DNA也容易降解的说
(99℃处理个几分钟热变性,DNA都降解得厉害~~)
3楼2008-08-29 15:14:20
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olivelmint

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2008-8-29 15:09:
1、不要vortex,DNA严重断裂。就算要vortex也不要超过5s
2、离心时要4℃离心

为什么不用经典的酚-氯仿法抽提呢?

您好,感谢你的回复!关键是外文文献上用的这个方法,觉得比常规的方法要省时,而且是纯物理反映,不用加任何的试剂。我基本和它的步骤一样,就是冷冻我用-70°,融化我用100°的,它DNA讲解有这么快吗?要不再按它的方法温柔一点?
4楼2008-08-29 15:35:44
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

其实DNA很怕物理因素的干扰的
我要提大片段,连枪头的尖端都要剪断,这样吸取的时候就不会有物理的切割因素存在
5楼2008-08-29 16:31:28
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

hehe

菌丝要嫩点,最好用干冰速冷,物理的张力破坏细胞壁.
6楼2008-08-31 02:47:10
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olivelmint

引用回帖:
Originally posted by 克隆大虾 at 2008-8-31 02:47:
菌丝要嫩点,最好用干冰速冷,物理的张力破坏细胞壁.

请问,干冰处理我用-70°的超低温处理来代替可以吗?这个环境温度变化更大,不是更容易破壁吗?
7楼2008-08-31 08:38:25
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