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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 大家在做western blot实验时，样品都是怎么处理的呀？
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Snuggle安

新虫 (初入文坛)

[求助] 大家在做western blot实验时，样品都是怎么处理的呀？ 已有2人参与

RT
最近要开始做Western blot，我的样品是动物药的细粉，样品制备的话是不是不能直接稀释上样？要是做前处理的话，需要怎么处理比较好呢？
我查了一些，发现每个不同的样品，处理方法也不同，大家做western时都是怎么处理样品的呢？
刚刚涉及生物这方面，新手很多东西都不太懂，大家一起来交流，我也多学习一下~
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1楼 2015-09-11 10:06:11
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kobe199613

木虫之王 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-09-11 22:58:23
Snuggle安: 金币+5 2015-09-12 10:52:45
我的样品使肌肉组织：取适量背最长肌样品，加入裂解液（0.15M NaCl，20mM Tris–HCl（pH 8.0），1mM
EDTA，1mM PMSF，0.1μM E-46，0.08μM aprotinin，0.1μM leupetin，0.1%NP-40）进
行匀浆并置冰上充分裂解 30min，之后再用超声波破碎仪处理，于 4℃下 12000rpm/min
离心 10min，取上清用 BCA 法测定蛋白含量后分装于 0.5mL 离心管中并置于-20℃保
存；取 50μg 蛋白与适量 5×上样缓冲液（0.25mol/L  Tris·HCl  pH6.8，0.5mol/L 二硫叔
糖醇，10% SDS，0.5%溴酚蓝，50%甘油）混合，煮沸 5min，在冰上冷却后用于 Western
blot 检测。
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【招聘】医用高分子材料研发工程师（北京）
6楼2015-09-11 21:31:51
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普通回帖

jingshuikeke

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-11 22:57:26
我的是细胞裂解蛋白  样品与5Xloading buffer 离心混匀后 95℃水浴煮5-10分钟 离心 冷却后 上样即可
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2楼2015-09-11 12:01:20
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-11 22:57:41
Snuggle安: 金币+2 2015-09-12 10:44:36
我有时候懒惰会直接把2X loading dye 加到移走培养液的细胞上面，再用枪头把蛋白吸出来
不是很正规，但是很快
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3楼2015-09-11 12:07:03
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380218013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-11 22:58:02
Snuggle安: 金币+3 2015-09-12 10:44:27
WB用于检测蛋白。你的样品肯定是中生物类的蛋白药物。稀释之前要选择buffer,生理盐水或者ＰＢＳ,混匀不要剧烈。既然做成药物了，应该知道含量是多少。适当的稀释，WB只需要一点的量既可以，只要抗体可以的话。
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好好生活，努力赚钱
4楼2015-09-11 13:36:02
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Snuggle安

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 380218013 at 2015-09-11 13:36:02
WB用于检测蛋白。你的样品肯定是中生物类的蛋白药物。稀释之前要选择buffer,生理盐水或者ＰＢＳ,混匀不要剧烈。既然做成药物了，应该知道含量是多少。适当的稀释，WB只需要一点的量既可以，只要抗体可以的话。

我的样品是动物药原材料磨成的细粉，是原材料，没做成药物。蛋白含量很高。
我查了一些其他的文献，我需不需要先裂解在上样呢？
稀释得用缓冲液对吗？
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5楼2015-09-11 14:54:41
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jeff瓜瓜

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-11 22:58:43
Snuggle安: 金币+2 2015-09-14 17:23:10
用裂解液提取蛋白，然后和上扬缓冲液混合后沸水煮5min，直接上样
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7楼2015-09-11 21:34:08
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Snuggle安

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jeff瓜瓜 at 2015-09-11 21:34:08
用裂解液提取蛋白，然后和上扬缓冲液混合后沸水煮5min，直接上样

请问一下，煮沸的目的是什么呢？
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8楼2015-09-12 10:43:29
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Snuggle安

新虫 (初入文坛)
你们用的裂解液的配比都是怎么确定的呀？
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9楼2015-09-12 10:47:30
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海绵船长

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Snuggle安 at 2015-09-12 10:43:29
请问一下，煮沸的目的是什么呢？...

蛋白需要变性。你去看看原理。

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10楼2015-09-12 11:10:18
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