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淘七九懒

铁杆木虫 (著名写手)

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[求助] red同源重组做敲除时电入片段后pcr无条带？？

如题，在大肠JM109中用red同源重组做敲除时，电入扩增好的片段，然后PCR验证是否敲除成功。照理说无论是否敲除成功，都该有条带的（若成功，该是1500bp;不成功，该是基因大小）。可我的PCR结果是阳性对照（肯定含该基因的菌）都有基因大小的条带，做了电击的都没有条带。。。然后我提基因组验证，有的敲除成功，可是抗性一直消不掉。
有以下问题：我的pcr是用95度10min预变性，95度30s变性。而且阳性对照都出了很好的条带，为甚么做了电击的菌做菌落pcr就没东西出来？而提了基因组又能有条带的？为啥后面消抗老不长？？

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敲除验证

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1楼2015-08-31 16:49:44

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痞子无敌

金虫 (正式写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

楼主好，我现在也遇到了这样的问题。就是做插入抗性进行基因敲除，现在菌落PCR验证出了问题，具体是这样：用kna双引物a,b进行菌落PCR，有目的条带；用目的基因前后双引物c,d（kan插入基因内部）进行菌落PCR，无任何条带。以上实验用的是同样的模板，同样的延伸时间，在同一台PCR仪中，也是同时做的。但是，没有预想中的结果。之前用c,d以基因组为模板，是有条带的，虽然特异性不太好，有杂带，但是菌落PCR时无任何结果，我没有想到原因。请问楼主后来问题解决了没有