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汕头大学海洋科学接受调剂
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淘七九懒

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] red同源重组做敲除时 电入片段后pcr无条带??

如题,在大肠JM109中用red同源重组做敲除时,电入扩增好的片段,然后PCR验证是否敲除成功。照理说无论是否敲除成功,都该有条带的(若成功,该是1500bp;不成功,该是基因大小)。可我的PCR结果是阳性对照(肯定含该基因的菌)都有基因大小的条带,做了电击的都没有条带。。。然后我提基因组验证,有的敲除成功,可是抗性一直消不掉。
有以下问题:我的pcr是用95度10min预变性,95度30s变性。而且阳性对照都出了很好的条带,为甚么做了电击的菌做菌落pcr就没东西出来?而提了基因组又能有条带的?为啥后面消抗老不长??
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铁虫 (小有名气)

师兄,我也要做基因敲除,能不能跟你交换一下做基因敲除的质粒呢。。。。。
2楼2015-09-12 08:37:28
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痞子无敌

金虫 (正式写手)

楼主好,我现在也遇到了这样的问题。就是做插入抗性进行基因敲除,现在菌落PCR验证出了问题,具体是这样:用kna双引物a,b进行菌落PCR,有目的条带;用目的基因前后双引物c,d(kan插入基因内部)进行菌落PCR,无任何条带。以上实验用的是同样的模板,同样的延伸时间,在同一台PCR仪中,也是同时做的。但是,没有预想中的结果。之前用c,d以基因组为模板,是有条带的,虽然特异性不太好,有杂带,但是菌落PCR时无任何结果,我没有想到原因。请问楼主后来问题解决了没有
当你当你的眼睛眯着笑
3楼2016-05-21 11:44:02
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