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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么用提藻的DNA做18sRNA的PCR就是做不出来
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启从QICONG

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么用提藻的DNA做18sRNA的PCR就是做不出来 已有1人参与

我提了三角褐指藻的总DNA，跑电泳，跑出来了，而且比marker还亮，但是我把总DNA稀释2、4、6、8倍做18sPCR，跑不出条带，后来查了一下资料，说做PCR的模板有1ng的DNA就够了。所以后来我又跑胶，估计了一下DNA的浓度，浓度应该是大于100ng/5ul的，就把提出来的DNA稀释了50倍、100倍、150倍、200倍再做18sRNA的PCR，但是后来跑胶还是没有跑出来，我想问问各位大神，这到底是怎么了？哪里出问题了？我接下来该怎么办？
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1楼 2015-08-31 15:35:07
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
启从QICONG: 金币+4, ★★★很有帮助, 太赞啦，谢谢啦 2015-09-02 11:53:47
不一定是1ng，看你是什么模板，不同来源的模板和上样量的要求，看资料里边有（http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html）
模板浓度，引物浓度，酶浓度这些东西按照酶的说明书操作都能扩增出来，跑不出来，稍微优化一下体系也差不多能有个结果，你不要只纠结于模板浓度，毕竟是分子实验多方面考虑啊，引物特异性验证，扩增酶要高特异性热启动聚合酶扩增，摸索温度条件等，祝成功
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-09-01 10:16:05
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启从QICONG

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-09-01 10:16:05
不一定是1ng，看你是什么模板，不同来源的模板和上样量的要求，看资料里边有（http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html）
模板浓度，引物浓度，酶浓度这些东西按照酶的说明书操作都能扩增出 ...

我后来用高保真酶p出来了，但条带不是很清晰，请问怎样改进才能让条带更亮一些
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3楼2015-09-03 13:12:45
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
引用回帖:
3楼: Originally posted by 启从QICONG at 2015-09-03 13:12:45
我后来用高保真酶p出来了，但条带不是很清晰，请问怎样改进才能让条带更亮一些...

优化实验条件
选择条带已经出来了，这是好事
退火温度，升高退火温度可以提高特异性，现在你这是条带不清楚，可以试试降低退火温度看，胶浓度也很重要，但往往会被忽视~
对模板引物浓度酶量也要摸索，说明书可以参考，如果结果不满意，还是要摸索优化条件的，毕竟模板不唯一嘛，另外实验做对照组，可以排除很多原因，还有参考marker
，没有图不好具体判断
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-09-06 09:50:51
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