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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于同源重组
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于同源重组 已有5人参与

谁能告诉我同源重组的反应温度为什么是50度，各种酶是怎么作用的，或者哪本参考书可以给我解答
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1楼 2015-08-29 19:25:13
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迷迭的微笑

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有这种说法吗？你在哪看到的啊？你做的哪方面啊？
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2楼2015-08-29 20:15:23
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该不是确定的50℃吧，我也不确定
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3楼2015-08-29 21:12:21
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jindiao

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Tama二等兵: 金币+20, ★★★很有帮助 2015-08-31 20:52:40
楼主说的是体外同源重组Gibson assembly实验条件吧？
简单来讲，这是位于Venter Institute的Gibson博士开发的一种体外同源重组技术，用于合成和获得大片段DNA的方法。具体原理请参见http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html
文献名：Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases
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4楼2015-08-30 08:23:22
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huangxin2011

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接用含有同源重组酶的菌株就可以了，
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5楼2015-08-31 09:11:34
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 迷迭的微笑 at 2015-08-29 20:15:23
有这种说法吗？你在哪看到的啊？你做的哪方面啊？

就是基因合成，将片段装质粒载体里去
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6楼2015-09-04 20:42:09
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2015-08-29 21:12:21
应该不是确定的50℃吧，我也不确定

可是我对这种重组机制不太懂，感觉像是同源重组，可是实际操作起来感觉不像，就是载体跟目标片段有重组臂，然后加重组酶50度反应一小时后转化就可以了
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7楼2015-09-04 20:44:19
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-10 23:00:19
引用回帖:
4楼: Originally posted by jindiao at 2015-08-30 08:23:22
楼主说的是体外同源重组Gibson assembly实验条件吧？
简单来讲，这是位于Venter Institute的Gibson博士开发的一种体外同源重组技术，用于合成和获得大片段DNA的方法。具体原理请参见http://www.nature.com/nmeth/j ...

您的意思是通过聚合酶的外切，使两段具有OVERLAP的DNA互补配对连接是吗？overlap一定要在两段DNA片段的首尾么？我们酶切载体时偶尔会取与目标酶切位点靠近的酶切位点（一般十几个bp），这样的话对重组影响大么？
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8楼2015-09-04 20:53:47
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jindiao

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by Tama二等兵 at 2015-09-04 20:53:47
您的意思是通过聚合酶的外切，使两段具有OVERLAP的DNA互补配对连接是吗？overlap一定要在两段DNA片段的首尾么？我们酶切载体时偶尔会取与目标酶切位点靠近的酶切位点（一般十几个bp），这样的话对重组影响大么？...

是同源重组机理，但是是三个酶，不是一个酶，与好多同源重组试剂盒不一样的是，Gibson assembly可以在体外形成闭合环状DNA，这点和传统的连接比较像。
稍微具体的原理是：
核酸外切酶（最适温度在37°左右）从各DNA片段5‘端开始水解（在50°也可以发挥作用，但是很快就会失去活力），由于它是单链水解酶，所以会暴露出一部分3’端的单链，这样同源的各DNA片段可以退火形成互补，这时DNA聚合酶开始作用（缓冲液内有dNTP，镁离子），把剩余的GAP补齐。然后高温连接酶（缓冲液内还需要NAD）将补齐的末端连接，形成共价闭合状态。
http://www.nature.com/nmeth/jour ... .html#opennewwindow
上述文章有着非常清晰的描述，你可以仔细看一下。
如果你的overlap不在首尾，有十几个pb的非同源区，我猜测应该也是可以的，但是效率会降低。
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9楼2015-09-10 09:27:03
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jindiao at 2015-09-10 09:27:03
是同源重组机理，但是是三个酶，不是一个酶，与好多同源重组试剂盒不一样的是，Gibson assembly可以在体外形成闭合环状DNA，这点和传统的连接比较像。
稍微具体的原理是：
核酸外切酶（最适温度在37°左右）从各 ...

您是指的不依赖连接的克隆是么？OVERLAP利用T4聚合酶消化出两条互补的单链，配对后利用taq酶扩增补足缺失部分，最后经连接酶形成磷酸二酯键，对于非同源序列，利用大肠杆菌聚合酶1的klenow大片段切掉环状质粒上的单链帽结构是么？谢谢您的帮助，刚接触质粒连接不久，之前我一直把它理解为同源重组，因为boss们称这段overlap为重组臂，之后发觉不太对，因为overlap有时候会有缺失，那么说这种重组本质还是连接是么？
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10楼2015-09-10 19:29:51
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