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Tama二等兵新虫 (初入文坛)
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[求助]
关于同源重组 已有5人参与
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| 谁能告诉我同源重组的反应温度为什么是50度，各种酶是怎么作用的，或者哪本参考书可以给我解答 |
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【答案】应助回帖
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是同源重组机理，但是是三个酶，不是一个酶，与好多同源重组试剂盒不一样的是，Gibson assembly可以在体外形成闭合环状DNA，这点和传统的连接比较像。 稍微具体的原理是： 核酸外切酶（最适温度在37°左右）从各DNA片段5‘端开始水解（在50°也可以发挥作用，但是很快就会失去活力），由于它是单链水解酶，所以会暴露出一部分3’端的单链，这样同源的各DNA片段可以退火形成互补，这时DNA聚合酶开始作用（缓冲液内有dNTP，镁离子），把剩余的GAP补齐。然后高温连接酶（缓冲液内还需要NAD）将补齐的末端连接，形成共价闭合状态。 http://www.nature.com/nmeth/jour ... .html#opennewwindow 上述文章有着非常清晰的描述，你可以仔细看一下。 如果你的overlap不在首尾，有十几个pb的非同源区，我猜测应该也是可以的，但是效率会降低。 |
9楼2015-09-10 09:27:03
2楼2015-08-29 20:15:23
3楼2015-08-29 21:12:21
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
Tama二等兵: 金币+20, ★★★很有帮助 2015-08-31 20:52:40
感谢参与，应助指数 +1
Tama二等兵: 金币+20, ★★★很有帮助 2015-08-31 20:52:40
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楼主说的是体外同源重组Gibson assembly实验条件吧？ 简单来讲，这是位于Venter Institute的Gibson博士开发的一种体外同源重组技术，用于合成和获得大片段DNA的方法。具体原理请参见http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html 文献名：Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases |
4楼2015-08-30 08:23:22