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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 各位大神，求助一下双向电泳横纹问题，跪谢！
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fe123333

金虫 (小有名气)

[求助] 各位大神，求助一下双向电泳横纹问题，跪谢！已有1人参与

各位大神，我做的是霉菌蛋白的双向电泳，用的是伯乐17cm ph 3-10 线性的胶条，染色方法为银染但是跑了很多次都有严重的横纹出现，不知道是提取蛋白时出了问题（盐离子之类的问题）还是等电聚焦程序设定出了问题。最近愁死了，都快抑郁了，谁能帮我分析一下，欢迎交流讨论。灰常感谢！！

下面是蛋白提取方法、等电聚焦程序和胶图。
提取总蛋白：
（1）研磨：预先将研钵置于-20℃的冰箱内冷冻；取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状；
（2）抽提：（将研磨好的组织转移到EP管中,按每100mg菌体组织加5O0ul的比例加提取试剂）向匀浆中加入5 ml的抽提液（20mM Tris-Cl，0.5% Triton X-100 (v/v)，0.5M EDTA，pH 8.0，0.07% β-巯基乙醇，蛋白酶抑制剂）；
（3）离心：12000 rpm，4℃，离心10 min，吸取上清于另一离心管中，尽量少吸上层色素。
（4）沉淀：利用氯仿甲醇沉淀法移除核酸和色素。

17cm胶条(PH3-10)的等电聚焦程序
水化        50V                14h        主动水化
S1        250V        线性        1h        除盐
S2        500V        线性        1h        除盐
S3        1000V        快速        1h        除盐
S4        10,000V        线性        5h        升压
S5        10,000V        快速        90,000Vh        聚焦
S6        500V        快速        12h        保持

各位大神，求助一下双向电泳横纹问题，跪谢！
大胶.jpg
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1楼2015-08-27 21:04:00
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fe123333

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by gcg98 at 2015-08-30 06:00:23
等电聚焦升压最高到多少？

聚焦升压最高到了10000v。您是说上样时还有部分蛋白没有溶解，以固体形式存在于裂解液中？
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4楼2015-09-01 09:27:53
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gcg98

木虫 (正式写手)
等电聚焦升压最高到多少？

发自小木虫Android客户端
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fe123333
2楼2015-08-30 06:00:23
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gcg98

木虫 (正式写手)
第一项上样没有完全溶解

发自小木虫Android客户端
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3楼2015-08-30 06:02:06
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fe123333

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gcg98 at 2015-08-30 06:02:06
第一项上样没有完全溶解

上样前我测了样品的电导，发现盐浓度不是很高，应该不是盐的问题
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5楼2015-09-01 09:54:01
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