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fe123333金虫 (小有名气)
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各位大神，求助一下双向电泳横纹问题，跪谢！ 已有1人参与
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各位大神，我做的是霉菌蛋白的双向电泳，用的是伯乐17cm ph 3-10 线性的胶条，染色方法为银染但是跑了很多次都有严重的横纹出现，不知道是提取蛋白时出了问题（盐离子之类的问题）还是等电聚焦程序设定出了问题。最近愁死了，都快抑郁了，谁能帮我分析一下，欢迎交流讨论。灰常感谢！！ 下面是蛋白提取方法、等电聚焦程序和胶图。 提取总蛋白： （1）研磨：预先将研钵置于-20℃的冰箱内冷冻；取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状； （2）抽提：（将研磨好的组织转移到EP管中,按每100mg菌体组织加5O0ul的比例加提取试剂）向匀浆中加入5 ml的抽提液（20mM Tris-Cl，0.5% Triton X-100 (v/v)，0.5M EDTA，pH 8.0，0.07% β-巯基乙醇，蛋白酶抑制剂）； （3）离心：12000 rpm，4℃，离心10 min，吸取上清于另一离心管中，尽量少吸上层色素。 （4）沉淀：利用氯仿甲醇沉淀法移除核酸和色素。 17cm胶条(PH3-10)的等电聚焦程序 水化 50V 14h 主动水化 S1 250V 线性 1h 除盐 S2 500V 线性 1h 除盐 S3 1000V 快速 1h 除盐 S4 10,000V 线性 5h 升压 S5 10,000V 快速 90,000Vh 聚焦 S6 500V 快速 12h 保持  大胶.jpg |
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fe1233332楼2015-08-30 06:00:23
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9楼2015-09-03 09:48:34
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【答案】应助回帖
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两个原因造成横纹严重，一是聚焦过度，建议程序为：30v12h,250v1h,500v1h,500v1h,1000v1h,1000v-10000v1h gradient,10000v50000vhs,2000v2h。二是胶条与SDS胶黏得不够紧，有气泡产生了 发自小木虫Android客户端 |
10楼2015-09-03 15:37:46
