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水草

[交流] 连接反应温度问题

我要做连接反应了，两个片段一个8000bp左右，一个4000bp左右，不知道最佳反应温度怎么确定。看资料有22度，14-16度，还有4度的。根据什么确定的反应温度呢？谢谢指教！
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1楼 2008-08-22 09:34:35
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+2,VIP+0):谢谢！
最佳反应温度是依据连接酶活性而定的，跟你的片段没有关系，不过片段比较大，可以延长连接时间，并添加一点ATP来促进连接成功率
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2楼2008-08-22 09:51:08
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫
★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+3,VIP+0):谢谢回答！
添加ATP和PEG，并低温延长连接时间，这样可以提高连接的几率
赞一下(14人) 回复此楼
3楼2008-08-22 10:24:43
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heyi_zju

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+3,VIP+0):感谢！
我是用TakaRa的试剂盒的话，用4度和16度都可以的，4度的话就是比较稳定，16度条件下比较快速，一般12hr左右就可以了。但是4度要2－3天时间。
除了添加ATP外，同时你还可以调整目的片段和载体的量。
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4楼2008-08-22 10:48:16
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+3,VIP+0):感谢回答！
16度就可以了， 不过你的外源片段比较大，可能要延长时间。但是连接还有其他的因素影响，例如你外源片段和载体浓度比例是否合理等等
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5楼2008-08-22 10:50:17
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+3,VIP+0):谢谢回答！
如果两个片段都很纯的话
正常配置连接体系
摩尔比 8000：4000=1：3
16度直接过夜或16度2-4小时然后4度过夜
基本都可以连接上
没什么特别的要求，应该很好连
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6楼2008-08-22 23:42:34
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tuotuozw

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
水草(金币+4,VIP+0):感谢回答！
那个片段是质粒呢？如果8000是质粒

闭上眼睛昨晚实验，回去吃饭睡个觉就可以做转化了


如果4000是质粒，8000是外源片段，那你就不要先急着吃饭哦！

好好做好纯化
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7楼2008-08-23 08:38:30
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tennisafin

木虫 (正式写手)
★
水草(金币+1,VIP+0):谢谢！
16度最好吧
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8楼2008-08-23 11:04:30
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恒星年

银虫 (正式写手)
★
水草(金币+1,VIP+0):谢谢！
一般买的连接酶的连接缓冲液中都含有ATP，放在4度可能是沉淀状态，用前放在37度溶解就可以了，不需要额外在加ATP了吧。可以加适量的PEG8000，16度连接过夜应该足够了，如果降低温度就要延长连接反应时间。
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9楼2008-08-23 20:02:41
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wjg_1979

木虫 (小有名气)

连接反应体系

★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复
PMD19-T载体：
solution 1:  5 ul
切胶产物：4.5 ul
vector:  0.5
16度１小时，４度过夜
PGEM-T or PGEM-T easy:
2x快速连接缓冲液：5 ul
PCR切胶产物:  3ul
T4DNA 连接酶：1ul
Vector:1ul
４度过夜

只是片段太大怕是难连，超过４000 bp的就应换其它载体了．．
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10楼2008-08-24 10:23:58
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