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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 连接反应温度问题
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水草

[交流] 连接反应温度问题

我要做连接反应了，两个片段一个8000bp左右，一个4000bp左右，不知道最佳反应温度怎么确定。看资料有22度，14-16度，还有4度的。根据什么确定的反应温度呢？谢谢指教！
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1楼 2008-08-22 09:34:35
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wjg_1979

木虫 (小有名气)

连接反应体系

★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复
PMD19-T载体：
solution 1:  5 ul
切胶产物：4.5 ul
vector:  0.5
16度１小时，４度过夜
PGEM-T or PGEM-T easy:
2x快速连接缓冲液：5 ul
PCR切胶产物:  3ul
T4DNA 连接酶：1ul
Vector:1ul
４度过夜

只是片段太大怕是难连，超过４000 bp的就应换其它载体了．．
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10楼2008-08-24 10:23:58
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+2,VIP+0):谢谢！
最佳反应温度是依据连接酶活性而定的，跟你的片段没有关系，不过片段比较大，可以延长连接时间，并添加一点ATP来促进连接成功率
赞一下(14人) 回复此楼
2楼2008-08-22 09:51:08
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫
★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+3,VIP+0):谢谢回答！
添加ATP和PEG，并低温延长连接时间，这样可以提高连接的几率
赞一下(14人) 回复此楼
3楼2008-08-22 10:24:43
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heyi_zju

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
水草(金币+3,VIP+0):感谢！
我是用TakaRa的试剂盒的话，用4度和16度都可以的，4度的话就是比较稳定，16度条件下比较快速，一般12hr左右就可以了。但是4度要2－3天时间。
除了添加ATP外，同时你还可以调整目的片段和载体的量。
赞一下(13人) 回复此楼
4楼2008-08-22 10:48:16
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