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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 细胞裂解液SDS-PAGE条带弥散严重
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cattee

新虫 (初入文坛)

[求助] 细胞裂解液SDS-PAGE条带弥散严重 已有2人参与

使用pcDNA3.1表达 HBV 核心蛋白，2*10^5cells/孔铺12孔板，1.6ug/孔质粒（含空质粒对照）质脂体法转染Huh7细胞，2孔一组，48,72,96小时收获细胞，使用自配细胞裂解液(含NP40及细胞裂解液）50ul裂解细胞，4度夜，12000rpm 取上清，10ul 上样，12% SDS-PAGE，80v跑完 浓缩胶，120V跑分离胶，然后就这德行了。

目的蛋白大小是23KD。
求大牛们帮忙看看怎么回事啊。。。

细胞裂解液SDS-PAGE条带弥散严重
20150825-hbc-pcdnda3.12-huh7-sdspage-blue2.jpg
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1楼 2015-08-25 16:40:08
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sk1981521

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可能裂解时间长了，冰上30min，试一下
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2楼2015-09-05 14:21:12
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顾在

新虫 (初入文坛)
胶未凝好或者样品有降解～

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3楼2015-09-06 06:41:34
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chenyuanxmc

金虫 (著名写手)
你的SDS-PAGE是不是存放时间过长，建议重新配胶。

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4楼2015-09-06 07:07:08
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fuding6

木虫 (小有名气)
感觉是电泳缓冲液没加sds

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5楼2015-09-06 07:16:25
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jl.liu

新虫 (初入文坛)
MAKER都不太看得见，胶没配好吧
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6楼2015-09-06 09:16:56
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七夕小思

新虫 (初入文坛)
请问楼主做的是HBsAg蛋白的吗？

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7楼2015-11-18 22:03:08
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七夕小思

新虫 (初入文坛)
用的是那个公司的抗体啊？

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8楼2015-11-18 22:03:45
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

1. marker跑到也不太好，所以可能配胶有问题，没混匀或者上下胶交接面没处理好。
2.裂解液加的量够不够，看样子蛋白浓度挺高的。
3.煮样时间稍微延长，但要密封好，防止样品干掉，上样前离心。
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9楼2015-11-19 13:18:29
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2233323

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by uulovelyuu at 2015-11-19 13:18:29
1. marker跑到也不太好，所以可能配胶有问题，没混匀或者上下胶交接面没处理好。
2.裂解液加的量够不够，看样子蛋白浓度挺高的。
3.煮样时间稍微延长，但要密封好，防止样品干掉，上样前离心。

请问上样前离心的转速和时间有要求吗？

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10楼2018-06-14 08:37:55
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