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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 为什么我的PCR结果总是不对？
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a15665819523

铜虫 (小有名气)

[求助] 为什么我的PCR结果总是不对？

最近我一直在做PCR，可是不管我怎么小心，结果总是出错，作为一个新人，我的信心完全被打击没了，我都对PCR产生恐惧了，这是什么原因呢？为什么我就总是做不出来，可是别人稍微一做，感觉都没怎么认真就做出了正确结果，这是为什么？
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要活得像毒品一样，要么惹不起，要么不能弃！
1楼 2015-08-23 20:39:09
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tonganlhy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-23 22:54:42
a15665819523: 金币+1 2015-08-24 16:04:51
每次做的时候同时做正对照和负对照，便于分析原因
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2楼2015-08-23 20:57:02
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半醒半梦

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-08-23 22:54:54
a15665819523: 金币+1 2015-08-24 16:04:36
a15665819523: 金币+3 2015-08-25 15:03:59
PCR结果不对是与自己预测的条带变大还是变小，最主要的原因是非特异性扩增。
1、产生非特异性扩增最主要原因是模板和引物不好，当引物原因排除了后，尽量用纯度高的模板，当然如果你用质粒作为模板，那随便扩都可以扩出来；
2、另外延伸时间也很重要，要选择合适的延伸时间，不能太长，也不能太短；
3、最后就是选择高保真和高效率的酶。
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只要想起一生中后悔的事，梅花便落满了南山。
3楼2015-08-23 21:03:07
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我是鱼豆腐

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-08-23 22:55:13
a15665819523: 金币+2 2015-08-24 16:06:42
a15665819523: 金币+5 2015-08-25 15:04:11
同学没事，刚开始做分子生物实验的时候我们大家都是这样过来的，我之前也是pcr跑不出来看到电泳仪和pcr机器就苦恼，后来静下心来仔细分析找到问题出在哪里就好了，下面是我的一些经验，希望对你有用。
    1、PCR模板的问题。很多情况下我们提取的DNA浓度纯度虽然很好，但仍然跑不出来，这就有可能是震荡时时间过长，导致DNA变成小片段，所以你会遇到浓度不错，纯度也在1.8以上仍然跑不出来的情况，解决方法就是提取dna时注意不要太剧烈太长时间的震荡，改进你提取DNA的方法，记得最后稀释到10到100ng每微升就好。
   2、pcr条件问题。我们一般用的都是别人跑成功的引物，所以我们也会完全参照别人的pcr条件，如果跑不出来就需要确定在你的实验条件下的退火温度，建议跑梯度PCR，两两间隔两度，50~60摄氏度通常是，一次就能测出来最适合的退火温度。
   3、跑胶条件。太多的人跑出来的胶要么月牙型，要么牛角型，再要么就是缓冲液不及时换电泳仪不勤洗之类问题，反正只要是我跑电泳肯定要洗一次电泳仪的，最后用TBE润洗，还有我的条件是110v30min，跑出来很好，缓冲液建议用了7~8次后就换。
    4、再其他的问题就是仪器啊试剂方面的，你再多注意下，心细些就好。
    祝你好运~
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4楼2015-08-23 21:19:31
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蓬山远音

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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a15665819523: 金币+1 2015-08-24 16:04:20
a15665819523: 金币+1 2015-08-25 15:04:22
有可能设计引物时有的需要补密码子，你看看有没有漏掉。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2015-08-24 07:53:26
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哈哈哈哈hhhh
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我是鱼豆腐 at 2015-08-23 21:19:31
同学没事，刚开始做分子生物实验的时候我们大家都是这样过来的，我之前也是pcr跑不出来看到电泳仪和pcr机器就苦恼，后来静下心来仔细分析找到问题出在哪里就好了，下面是我的一些经验，希望对你有用。
    1、PCR模 ...

6楼2015-08-24 15:09:58
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a15665819523

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tonganlhy at 2015-08-23 20:57:02
每次做的时候同时做正对照和负对照，便于分析原因

做了阴性对照，可奇怪的是，阴性对照没有条带，但是其他的也不该有条带的有了！而且不止一个。
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7楼2015-08-24 16:01:06
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a15665819523

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 半醒半梦 at 2015-08-23 21:03:07
PCR结果不对是与自己预测的条带变大还是变小，最主要的原因是非特异性扩增。
1、产生非特异性扩增最主要原因是模板和引物不好，当引物原因排除了后，尽量用纯度高的模板，当然如果你用质粒作为模板，那随便扩都可以 ...

我主要是做阴阳性检测，对条带大小要求不是很高，我的问题是该阴性的可能结果出现阳性，阳性的反而有事成了阴性
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要活得像毒品一样，要么惹不起，要么不能弃！
8楼2015-08-24 16:02:58
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a15665819523

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 蓬山远音 at 2015-08-24 07:53:26
有可能设计引物时有的需要补密码子，你看看有没有漏掉。

引物应该没问题，就是做出该有的结果感觉像是小概率事件，一次一个结果的样子
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9楼2015-08-24 16:04:11
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a15665819523

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我是鱼豆腐 at 2015-08-23 21:19:31
同学没事，刚开始做分子生物实验的时候我们大家都是这样过来的，我之前也是pcr跑不出来看到电泳仪和pcr机器就苦恼，后来静下心来仔细分析找到问题出在哪里就好了，下面是我的一些经验，希望对你有用。
    1、PCR模 ...

谢谢~
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10楼2015-08-24 16:06:33
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