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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » Taqman探针法RT-PCR的实验体系实验步骤哪位大神能够发一下！！
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喜自然果冻

新虫 (初入文坛)

[求助] Taqman探针法RT-PCR的实验体系实验步骤哪位大神能够发一下！！ 已有4人参与

网上找的基本都是燃料法的，探针法的也只是一些原理，我想要实际实验的体系、步骤的，哪位大牛能发一下
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1楼 2015-08-14 16:08:59
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Wuyou115

金虫 (正式写手)
这个不是按照kit来的么？，加Taq, probe,rox什么的。。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-08-15 00:41:26
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helios_hj

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据每个试剂盒说明书，里面有推荐的反应体系和反映条件，还有你做的是RNA还是DNA核酸，反应条件都不一样。
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Ifyouthinkyoucan,youcan!!!
3楼2015-08-15 10:18:00
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喜自然果冻

新虫 (初入文坛)
RT-PCR，一步法的
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4楼2015-08-17 08:36:11
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vivd娟

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说明书里有的啊，亲 不同的体系，适用的仪器都有对应的
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5楼2015-08-17 10:13:56
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

先做PCR，然后把产物进行实时，加入TaqMan探针的量根据说明书来，BioRad的试剂盒还不错
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6楼2015-08-18 15:42:55
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喜自然果冻

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bloodwar at 2015-08-18 15:42:55
先做PCR，然后把产物进行实时，加入TaqMan探针的量根据说明书来，BioRad的试剂盒还不错

已经做实验了，结果出来初始荧光值很高，到达2万多了，求解，谢谢
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7楼2015-08-25 10:34:53
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喜自然果冻

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Wuyou115 at 2015-08-15 00:41:26
这个不是按照kit来的么？，加Taq, probe,rox什么的。。

ROX是指那个ROX Reference Dye吗，用于校正孔与孔之间的荧光信号误差的？一定要加吗？
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8楼2015-08-25 10:38:02
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lcree

新虫 (初入文坛)
直接用试剂盒来做，然后按照说明书操作即可。我们实验室以前用过一款BIOG荧光定量PCR试剂盒，效果挺不错的。他们染料法和探针法都有的，你可以了解一下。
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9楼2018-09-21 13:57:03
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宇宙小妖怪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

 基本步骤：1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；
2、 引物、探针的设计；
3、 引物探针的合成；
4、 反应体系的配制；
5、 反应条件的设定；
6、 反应体系和条件的优化；
7、 荧光曲线和数据分析；
8、 标准品的制备；
Biodai Taqman 探针设计 一般设计原则：
 探针位置尽可能地靠近上游引物；
 探针长度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。
 探针的5’端应避免使用碱基G。
 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
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10楼2019-02-19 08:43:22
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