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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 原核表达始终构建载体不成功！！！！
汕头大学海洋科学接受调剂
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院士陈

铁虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达始终构建载体不成功！！！！ 已有4人参与

本人近几个月一直在做原核表达可是怎么都构建不出重组质粒，我要表达的目的基因全序列1950bp，起初做TA克隆都是一次性完成，但是当做表达切除信号肽加酶切位点时，片段大小约1900bp怎么都连不上表达载体，当实验室的师兄说先把片段连入T载体，再连表达载体，可是这时怎么都连不少T载体了，按理来说，片段变小了应该更好连才是呀，可是怎么都没连上每次连接都有算载体与目的DNA的质量比，就是1:3～1:8。可是就算这样还是没有的心好累，看不到前方的曙光，跪求木虫吧大神指点迷津，愿天下好人一生平安！！！

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1楼 2015-08-11 00:34:15
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按照你的说法，那就是连接体系、连接条件可能有问题。把你的具体体系和条件写一下
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2楼2015-08-11 08:19:47
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jinxuan0904

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-14 23:29:20
先连到T-vector，再做酶切和胶回收，再按比例连~
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3楼2015-08-11 09:45:10
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加285772160谈吧 具体跟你说一下

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4楼2015-08-11 10:37:24
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院士陈

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 673643401 at 2015-08-11 08:19:47
按照你的说法，那就是连接体系、连接条件可能有问题。把你的具体体系和条件写一下

连接体系10ul的 二十的都试过了，不行呀，而且我每次连接都是16度过夜的。

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5楼2015-08-13 15:41:11
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院士陈

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jinxuan0904 at 2015-08-11 09:45:10
先连到T-vector，再做酶切和胶回收，再按比例连~

对呀，问题的关键是自从我把我的片段切去信号肽了T载体一点都不好连，完全连不上了

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6楼2015-08-13 15:44:28
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jinxuan0904

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 院士陈 at 2015-08-13 15:44:28
对呀，问题的关键是自从我把我的片段切去信号肽了T载体一点都不好连，完全连不上了
...

你切了信号肽，后面的三个A是不是掉了！！！
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7楼2015-08-14 20:21:02
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院士陈

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinxuan0904 at 2015-08-14 20:21:02
你切了信号肽，后面的三个A是不是掉了！！！...

什么三个A？你是说三个A？

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8楼2015-08-16 12:29:27
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ljzdhdh0

铁虫 (小有名气)
一楼现在可在？看你的阐述，实验过程存在疑问，关键点在于：你去掉信号肽部分的DNA并引入酶切点是如何做的？
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9楼2015-08-16 15:23:11
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sunqx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

陈院士，您好。实验遇到问题的时候，所有用的东西全换新的，重新做。是所有东西。

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10楼2015-08-16 15:39:14
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