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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 融合PCR
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夏夜微风

木虫 (正式写手)

[求助] 融合PCR 已有2人参与

最近做了融合PCR，做了十多天。
三个片段①522bp，②1274bp，③587bp
引物①-F:cgcgatatcttatgtatgctcttctgacttttcg；①-R:gttatgcggccgctttgattgatttgactgtgttattttg
引物②-F:cgcaaaataacacagtcaaatcaatcaaagcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatcgttttaagagcttggtgagc;
       ②-R:tatacgaagttattgtgcggtatttcacaccgc
引物③-F:catatgcggtgtgaaataccgcacaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatccgcgggcgatttaatctctaattattag
       ③-R:cgcgatatctttcaatcattggagcaatcattttac
50ul反应体系：
5× Buffer（5mM Mg2+ plus）                    10ul
dNTP Mixture（2.5mM each）                     4.5ul
DNA polymerase（2.5unit/ul）                      0.5ul
模版1                                                            0.5ul
模版2                                                            0.5ul
模版3                                                             0.5ul
ddH2O                                                           33.5ul
PCR反应条件：
Volume：50ul
1. 98℃，10s
2. 98℃，10s
3. 51℃，3min
     +0.2℃ per cycle
     +12s per cycle
4. 72℃，2min30s
5. GOTO step2，10×
6. 72℃，10min
7. 4℃，∞
然后加引物①-F、③-R再PCR
PCR反应条件：
Volume：20ul
1. 94℃，30s
2. 94℃，30s
3. 53℃，1min
4. 72℃，3min
5. GOTO step2，27×
6. 72℃，10min
7. 12℃，∞
跑出来的条带在2300左右。但是胶回收在进行PCR验证时，却没有2300bp左右的条带了，这是为什么啊？
①-F×②-R；②-F×③-R；①-F×③-R三组引物进行PCR，但没有相应条带，这到底是为什么啊？
PCR反应条件：
Volume：20ul
1. 94℃，1min
2. 94℃，30s
3. 53℃，1min
4. 72℃，3min
5. GOTO step2，27×
6. 72℃，10min
7. 12℃，∞
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还未成熟，就已老去！
1楼 2015-08-09 10:50:37
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段2和片段3的引物不好，二级结构太多了
①-F×②-R以及②-F×③-R的融合PCR没有扩增出相应条带，多半原因在于引物
赞一下 回复此楼
2楼2015-08-10 13:20:25
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chengjie0801

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主的问题解决了吗？ 我做的也是类似的项目。 我的融合反应使用的是普通PCR 设计，不是楼主梯度式扩增， 最后得到的是弥散的条带。 不知道是什么原因，请问楼主知道原因吗？
赞一下 回复此楼
3楼2016-03-10 13:33:23
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夏夜微风

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chengjie0801 at 2016-03-10 13:33:23
请问楼主的问题解决了吗？ 我做的也是类似的项目。 我的融合反应使用的是普通PCR 设计，不是楼主梯度式扩增， 最后得到的是弥散的条带。 不知道是什么原因，请问楼主知道原因吗？

我做出来了，重新设计的引物，两头的的做融合，再进行酶切连接把中间的连上
赞一下 回复此楼
还未成熟，就已老去！
4楼2016-03-10 18:28:34
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