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夏夜微风木虫 (正式写手)
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融合PCR 已有2人参与
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最近做了融合PCR，做了十多天。 三个片段①522bp，②1274bp，③587bp 引物①-F:cgcgatatcttatgtatgctcttctgacttttcg；①-R:gttatgcggccgctttgattgatttgactgtgttattttg 引物②-F:cgcaaaataacacagtcaaatcaatcaaagcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatcgttttaagagcttggtgagc; ②-R:tatacgaagttattgtgcggtatttcacaccgc 引物③-F:catatgcggtgtgaaataccgcacaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatccgcgggcgatttaatctctaattattag ③-R:cgcgatatctttcaatcattggagcaatcattttac 50ul反应体系： 5× Buffer（5mM Mg2+ plus） 10ul dNTP Mixture（2.5mM each） 4.5ul DNA polymerase（2.5unit/ul） 0.5ul 模版1 0.5ul 模版2 0.5ul 模版3 0.5ul ddH2O 33.5ul PCR反应条件： Volume：50ul 1. 98℃，10s 2. 98℃，10s 3. 51℃，3min +0.2℃ per cycle +12s per cycle 4. 72℃，2min30s 5. GOTO step2，10× 6. 72℃，10min 7. 4℃，∞ 然后加引物①-F、③-R再PCR PCR反应条件： Volume：20ul 1. 94℃，30s 2. 94℃，30s 3. 53℃，1min 4. 72℃，3min 5. GOTO step2，27× 6. 72℃，10min 7. 12℃，∞ 跑出来的条带在2300左右。但是胶回收在进行PCR验证时，却没有2300bp左右的条带了，这是为什么啊？ ①-F×②-R；②-F×③-R；①-F×③-R三组引物进行PCR，但没有相应条带，这到底是为什么啊？ PCR反应条件： Volume：20ul 1. 94℃，1min 2. 94℃，30s 3. 53℃，1min 4. 72℃，3min 5. GOTO step2，27× 6. 72℃，10min 7. 12℃，∞ |
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