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linzshit

银虫 (小有名气)

[求助] 为啥蜡块提取出来的RNA做为模板做出来的熔解曲线没有新鲜组织的干净 已有1人参与

现在小弟在做蜡块组织mRNA表达量的试验，得出了一个比较神奇的结果，因为蜡块组织比较有限而且提取RNA浓度低，所以开始设计实验验证扩增效率的时候都是用的新鲜组织提出来的RNA转成的cDNA，用这个时在Ct=31左右的时候熔解曲线一直是一个峰，但是差不多同样的Ct值，蜡块组织提出来的RNA转cDNA为模板的熔解曲线就是两个峰，阴性虽然抬起，但峰位置也不是那里，求大神解答。

为啥蜡块提取出来的RNA做为模板做出来的熔解曲线没有新鲜组织的干净
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1楼 2015-08-07 16:05:57
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timmy1028

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RNase是广泛存在于环境中的，这个相信你是知道的，石蜡肯定不是RNase free的；
石蜡包埋的过程经过高温，高温对于保存RNA不利；
检测RNA是否降解的指标不是A260/A280，而是跑电泳看5S降解带是否明显，28S／18S是否正确；
你的这个结果，明显是RNA降解了。以后在转cDNA前，要先电泳检测RNA是否降解严重
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2楼2015-08-08 02:51:14
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linzshit

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by timmy1028 at 2015-08-08 02:51:14
RNase是广泛存在于环境中的，这个相信你是知道的，石蜡肯定不是RNase free的；
石蜡包埋的过程经过高温，高温对于保存RNA不利；
检测RNA是否降解的指标不是A260/A280，而是跑电泳看5S降解带是否明显，28S／18S是否 ...

这个倒是我也考虑到了,可是降解了以后反转录的cDNA模板在后期的PCR中就不会对数扩增了吧，这个峰还是挺高的，而且我跑电泳也是两条带。这个是我一直想不明白的事情。
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3楼2015-08-10 17:31:20
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