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做敲除，希望虫友能够分享一点点CRISPR Cas9 px458质粒 已有2人参与
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| 想做一个癌细胞敲除细胞系，希望大家能够分享我一点CRISPR px458质粒，感谢各位有爱的虫友！ |
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wufeng1991
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2楼2015-08-06 07:47:09
3楼2015-08-06 10:18:56
4楼2015-08-06 14:03:28
5楼2015-08-06 14:05:28
wufeng1991
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6楼2015-08-06 14:45:58
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Q？ |
7楼2015-08-06 15:00:03
kangaroo0513
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8楼2015-08-07 01:33:29
9楼2015-08-07 09:51:51
【答案】应助回帖
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CRISPR/Cas9基因敲除阳性单克隆筛选： 可以采用有限稀释法筛选单克隆（如果您的敲除载体有puro等抗性，需要将电转后的细胞药杀后再有限稀释筛选单克隆），具体步骤如下： 1.将电转后pool细胞有限稀释至96孔板中，待3-4个星期后，单克隆细胞生长至足量，使用Genloci TNA抽提试剂盒提取基因组（针对微量样品，少到500个细胞的基因组提取）； 2.PCR敲除位点附近序列（可自行在靶位点前后合适位置设计检测引物）、Cruiser™基因敲除检测试剂盒筛选阳性克隆（错配酶酶切跑电泳方法）； 3.对第2步初筛的阳性克隆进行测序验证，对于两个等位基因不同敲除的克隆再进行TA克隆后测序验证，序列比对分析基因敲除情况。 最后筛出我们想要的单克隆。 |
10楼2015-08-17 10:39:23
