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常浩

金虫 (正式写手)

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[求助] 做敲除，希望虫友能够分享一点点CRISPR Cas9 px458质粒已有2人参与

想做一个癌细胞敲除细胞系，希望大家能够分享我一点CRISPR px458质粒，感谢各位有爱的虫友！

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一个人可以被毁灭,但不可以被打败

1楼 2015-08-05 18:54:18

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小刀188

金虫 (正式写手)

应助: 56 (初中生)
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专业: 细胞增殖、生长与分化

【答案】应助回帖

CRISPR/Cas9基因敲除阳性单克隆筛选：
可以采用有限稀释法筛选单克隆（如果您的敲除载体有puro等抗性，需要将电转后的细胞药杀后再有限稀释筛选单克隆），具体步骤如下：
1.将电转后pool细胞有限稀释至96孔板中，待3-4个星期后，单克隆细胞生长至足量，使用Genloci TNA抽提试剂盒提取基因组（针对微量样品，少到500个细胞的基因组提取）；
2.PCR敲除位点附近序列（可自行在靶位点前后合适位置设计检测引物）、Cruiser™基因敲除检测试剂盒筛选阳性克隆（错配酶酶切跑电泳方法）；
3.对第2步初筛的阳性克隆进行测序验证，对于两个等位基因不同敲除的克隆再进行TA克隆后测序验证，序列比对分析基因敲除情况。
最后筛出我们想要的单克隆。