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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 做敲除，希望虫友能够分享一点点CRISPR Cas9 px458质粒
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常浩

金虫 (正式写手)

[求助] 做敲除，希望虫友能够分享一点点CRISPR Cas9 px458质粒 已有2人参与

想做一个癌细胞敲除细胞系，希望大家能够分享我一点CRISPR px458质粒，感谢各位有爱的虫友！
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一个人可以被毁灭,但不可以被打败
1楼 2015-08-05 18:54:18
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wufeng1991

新虫 (小有名气)
我有，可以交换

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-08-06 07:47:09
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yzhhui

新虫 (初入文坛)
分享的质粒发文章时会不会有麻烦啊？addgene库里可以买到现成的
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3楼2015-08-06 10:18:56
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常浩

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yzhhui at 2015-08-06 10:18:56
分享的质粒发文章时会不会有麻烦啊？addgene库里可以买到现成的

哦 如果是原始质粒的话就没问题，addgene比较慢，我是自己想私下做一下，老板应该不给买的。谢谢啦！
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一个人可以被毁灭,但不可以被打败
4楼2015-08-06 14:03:28
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常浩

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-06 07:47:09
我有，可以交换

交换？我之前有px330和335，但是留在学校了，新的工作地方什么都没有？你想要什么质粒呢？我帮你问问
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一个人可以被毁灭,但不可以被打败
5楼2015-08-06 14:05:28
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wufeng1991

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 常浩 at 2015-08-06 14:05:28
交换？我之前有px330和335，但是留在学校了，新的工作地方什么都没有？你想要什么质粒呢？我帮你问问...

2755157061

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-08-06 14:45:58
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常浩

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-06 14:45:58
2755157061
...

Q？
7楼2015-08-06 15:00:03
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个质粒在路上，估计几天就能到手，可以帮我留意AAV的空载体，或者retro的辅助质粒（Ampho等）交换么？151354061 我是个人，不是公司。
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8楼2015-08-07 01:33:29
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常浩

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-08-07 01:33:29
这个质粒在路上，估计几天就能到手，可以帮我留意AAV的空载体，或者retro的辅助质粒（Ampho等）交换么？151354061 我是个人，不是公司。

AAV的空载体比如？好的，我帮你问问。
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一个人可以被毁灭,但不可以被打败
9楼2015-08-07 09:51:51
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

CRISPR/Cas9基因敲除阳性单克隆筛选：
可以采用有限稀释法筛选单克隆（如果您的敲除载体有puro等抗性，需要将电转后的细胞药杀后再有限稀释筛选单克隆），具体步骤如下：
1.将电转后pool细胞有限稀释至96孔板中，待3-4个星期后，单克隆细胞生长至足量，使用Genloci TNA抽提试剂盒提取基因组（针对微量样品，少到500个细胞的基因组提取）；
2.PCR敲除位点附近序列（可自行在靶位点前后合适位置设计检测引物）、Cruiser™基因敲除检测试剂盒筛选阳性克隆（错配酶酶切跑电泳方法）；
3.对第2步初筛的阳性克隆进行测序验证，对于两个等位基因不同敲除的克隆再进行TA克隆后测序验证，序列比对分析基因敲除情况。
最后筛出我们想要的单克隆。
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10楼2015-08-17 10:39:23
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