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做好定点突变后怎么进行筛选?怎么确定有没有突变好啊? [ Last edited by 350784478 on 2009-7-14 at 10:21 ] |
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2楼2008-08-11 10:03:20
bioman9810
木虫 (著名写手)
千娇百媚是哥的妞儿
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3楼2008-08-11 10:03:26
4楼2008-08-11 11:17:30
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reasonspare(金币+5,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
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如果想确定必需拿去测序,或者由于突变产生或丢失了酶切位点,这样转化之后就可以提取质粒,酶切验证一下 如果没有相关酶切位点,又想提高送测序的阳性率,就要去除掉原始的未突变的质粒DNA 方法是选用从dam+菌株纯化而来的DNA作为模板,由于PCR产物是未甲基化的质粒,而只有当识别位点被甲基化时,才能被Dpn I 切割,所以使用Dpn I 对突变PCR产物进行Dpn I 消化。 (5' ... G A-CH3^T C ... 3' 3' ... C T^A-CH3 G ... 5' ) 理论上这样可以使原始质粒降解,而只保留新的突变体,转化后,理论上长出来的就是你要的阳性克隆。 当然有很多时候点突变要靠运气,包括你设计的突变引物是否好用 因为有些聚合酶会有3`---5`校正功能(如PFU),所以突变点离末端太近是会被纠错的,所以即使有PCR产物,序列也同原始序列一致,不是你想要的突变体 ![]() ![]() |
5楼2008-08-11 22:36:29
6楼2008-08-12 09:45:19
beckham277
木虫 (职业作家)
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