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sunmaocai

铜虫 (小有名气)

[交流] 求助 关于筛选

做好定点突变后怎么进行筛选?怎么确定有没有突变好啊？

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-14 at 10:21 ]
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1楼 2008-08-11 09:49:23
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+5,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
引用回帖:
Originally posted by sunmaocai at 2008-8-11 09:49:
做好定点突变后怎么进行筛选?怎么确定有没有突变好啊？

如果想确定必需拿去测序，或者由于突变产生或丢失了酶切位点，这样转化之后就可以提取质粒，酶切验证一下
如果没有相关酶切位点，又想提高送测序的阳性率，就要去除掉原始的未突变的质粒DNA

方法是选用从dam+菌株纯化而来的DNA作为模板，由于PCR产物是未甲基化的质粒，而只有当识别位点被甲基化时，才能被Dpn I 切割，所以使用Dpn I 对突变PCR产物进行Dpn I 消化。
（5' ... G A-CH3^T C ... 3'
3' ... C T^A-CH3 G ... 5' ）
理论上这样可以使原始质粒降解，而只保留新的突变体，转化后，理论上长出来的就是你要的阳性克隆。
当然有很多时候点突变要靠运气，包括你设计的突变引物是否好用
因为有些聚合酶会有3`---5`校正功能（如PFU），所以突变点离末端太近是会被纠错的，所以即使有PCR产物，序列也同原始序列一致，不是你想要的突变体
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5楼2008-08-11 22:36:29
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hqhe

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
你用的什么方法？
有的用的是定点突变试剂盒，这个我从没用过所以不知道
我一直用的笨办法也就是设计因为做重叠PCR，用测序的方法鉴定，这个结果最直观最可靠，不管你有没有其它方法能验证最终都必须用测序来验证
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2楼2008-08-11 10:03:20
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bioman9810

木虫 (著名写手)

千娇百媚是哥的妞儿
帮顶帮顶帮顶
等高手来解答~~
赞一下 回复此楼
头搭毛巾也掩盖不住哥耀眼的光芒，哥一直帅的很低调，仰角45°深深陶醉中....
3楼2008-08-11 10:03:26
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mark32280667806

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
没有突变的基因的表达产物有没有什么生物学功能，如果有，可以从这方面着手准备！！！
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4楼2008-08-11 11:17:30
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