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求助 关于筛选
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做好定点突变后怎么进行筛选?怎么确定有没有突变好啊？ [ Last edited by 350784478 on 2009-7-14 at 10:21 ] |
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4楼2008-08-11 11:17:30
2楼2008-08-11 10:03:20
bioman9810
木虫 (著名写手)
千娇百媚是哥的妞儿
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1651.6
- 帖子: 1347
- 在线: 44分钟
- 虫号: 581788
- 注册: 2008-07-18
- 性别: GG
- 专业: Helix
3楼2008-08-11 10:03:26
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reasonspare(金币+5,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
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如果想确定必需拿去测序，或者由于突变产生或丢失了酶切位点，这样转化之后就可以提取质粒，酶切验证一下 如果没有相关酶切位点，又想提高送测序的阳性率，就要去除掉原始的未突变的质粒DNA 方法是选用从dam+菌株纯化而来的DNA作为模板，由于PCR产物是未甲基化的质粒，而只有当识别位点被甲基化时，才能被Dpn I 切割，所以使用Dpn I 对突变PCR产物进行Dpn I 消化。 （5' ... G A-CH3^T C ... 3' 3' ... C T^A-CH3 G ... 5' ） 理论上这样可以使原始质粒降解，而只保留新的突变体，转化后，理论上长出来的就是你要的阳性克隆。 当然有很多时候点突变要靠运气，包括你设计的突变引物是否好用 因为有些聚合酶会有3`---5`校正功能（如PFU），所以突变点离末端太近是会被纠错的，所以即使有PCR产物，序列也同原始序列一致，不是你想要的突变体  |
5楼2008-08-11 22:36:29
