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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】凝胶电泳：为什么制出来的胶会这样
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dongdong00

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助】凝胶电泳：为什么制出来的胶会这样

由于目标蛋白的分子量大约在8 kDa ，为了分离这些蛋白，我想选择尝试用20%的分离胶。但是在制胶的过程中，发现制出来的胶和玻璃板之间总是会出现一些气泡状花纹（道胶的时候没有气泡），看起来似乎是胶和玻璃板贴合的不紧密。这些气泡开始的时候没有，但是聚合5分钟左右就开始出现，而且越来越多。一般在玻璃板的两边开始出现。做了好多次都是这样，不知道是什么原因。请大家帮忙分析一下。谢谢！
其中分离胶的配置：
H2O(ml)                       1.6
30%丙烯酰胺        13
1.5mol/lTrisHCl
(PH8.8) (ml)        5
10%SDS(ml)        0.2
10%AP(ml)                       0.2
TEMED(μl)                        7
总体积(ml)                       20

[ Last edited by dongdong00 on 2008-7-31 at 16:59 ]
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1楼 2008-07-31 16:55:50
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
dongdong00(金币+1,VIP+0):谢谢。
1、加了AP和TEMED之后要剧烈震荡（之前也要震荡几下），因为聚合的时候是排气的过程。我用50ml的离心管来配胶，所以震荡起来很方便
2、是不是玻璃板没有硅化好？
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2楼2008-07-31 21:31:25
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★
dongdong00(金币+3,VIP+0):我觉得你分析的很对，我做了各种比例的胶，发现胶浓度越大，产生那样的花纹就会越多。谢谢你的意见，我会尝试一下的
从楼主描述的情况看应该是因为胶浓度太大，在胶凝固过程中体积缩小，导致与玻璃板分离所致。
这种情况下，胶一般是可以用的（我们配的胶偶尔出现这样情况，基本无影响）

建议：如果想分离这种目标蛋白，必然要在有限的胶长度上提高分辨率，而提高分辨率的方法不能一味的提高胶浓度。有一种办法是配制正常15%分离胶，但配方中的水用等量的甘油替换，楼主不妨试试，可以达到意想不到的效果。（有什么细节不清楚的，欢迎与我共同探讨）
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3楼2008-08-01 01:59:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
dongdong00(金币+1,VIP+0):谢谢。
其实，15%的胶已经够浓了，连小分子RNA都能分离，更何况是8kD的蛋白
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4楼2008-08-01 09:01:49
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hu6704526

银虫 (小有名气)
按楼主的情况来看，我觉得分离这么大的蛋白质的话可以利用一个梯度的凝胶会好点，节省电泳的时间啊，而且效果也不错的。有关气泡我也遇到过，可能也是如上面所说的是浓度太大的原因，其实分离8K的没有必要用那么大浓度的
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5楼2008-08-01 22:58:08
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playboy723

金虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
应该是板子没有洗干净  有油脂的污染  你拿洗洁精好好洗洗
另外配完分离胶后一定要封胶   防止空气进入   总之  配胶是很关键的步骤  一定要仔细   否则下游的试验将是白搭
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6楼2008-08-02 18:14:02
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dongdong00

银虫 (小有名气)
不知道为什么，降低胶的浓度到12%也还有这样的现象，奇怪了。不知道大家知不知道要怎么避免
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7楼2008-08-04 16:09:52
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yyjack

12%的胶，看到一个同学出现过这种情况，一天做了3快板子，还是不行，最后重新配了tris-hcl，再制胶就好了。原来老液已经3个月了。
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8楼2008-08-19 23:47:15
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zhengchen5916

铜虫 (小有名气)
所有试剂倒掉重配！
还有，过硫酸铵的连是不是太多了，建议少加点试试，我都是加90微升。
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9楼2008-09-25 15:02:45
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