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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » CODEHOP简并引物结果怎么看
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匿名

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11楼2015-10-14 12:54:50
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竹砚

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11楼: Originally posted by louis_cheung at 2015-10-14 12:54:50
一般正常的酶就行（如果模板和引物正常的话），我用PLATINUM Taq HIFI、TAKALA的 Primstar HS和GXL等，批不出来可能与模板和引物有关~你的模板和引物GC高吗？Tm是否合适？简并碱基数量及位置是否合适？...

模板验证过了是没有问题的，引物的GC含量不太高，PCR的退火温度是根据引物合成单上的TM值试的梯度。不太明白您说的简并碱基的位置，引物序列是这样的：
上游引物：CCWCCWGTNCCWGTNCCWAARATHAARGG，下游引物:TCDATRTCCAGYTCDATRAAYTCNACCCA。
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12楼2015-10-15 09:59:33
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匿名

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13楼2015-10-15 17:39:20
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竹砚

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13楼: Originally posted by louis_cheung at 2015-10-15 17:39:20
(⊙o⊙)…你这也太···太···
简并碱基也太多了吧？？还是平均分布的···
通常一条引物所含简并碱基一般不超过3~4个吧，这样PCR效果通常比较好~~如果简并碱基太多的话，尽量放在中间，至少远离3'端吧~~
例 ...

您是用普通PCR还是Touchdown PCR做的呢？我自己用codehop设计了几对引物，能不能麻烦您帮忙看一下，谢谢了~

>F-b6    5'-GATGTGCAGAAAGGATGGATTACTytngartayga-3'                  
                                                degen=32  temp= 60.7
>R-e3    5'-AGGATCATCAATATCCAGTTCAATAaaytcnaccca-3'  
                                                degen=8   temp= 60.3
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14楼2015-10-20 09:09:15
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竹砚

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13楼: Originally posted by louis_cheung at 2015-10-15 17:39:20
(⊙o⊙)…你这也太···太···
简并碱基也太多了吧？？还是平均分布的···
通常一条引物所含简并碱基一般不超过3~4个吧，这样PCR效果通常比较好~~如果简并碱基太多的话，尽量放在中间，至少远离3'端吧~~
例 ...

另一对：
>F-b6    5'-GATGTGCAGAAAGGATGGATTACTytngartayga-3'
                                                 degen=32  temp= 60.7
>R-f3    5'-TGAAAATCTGTTTCTGGAATATCTggntcryarca-3'
                                                degen=32  temp= 61.8
这两对引物的上游是一样的。今天试了一下 F-b6,R-e3那一对引物的梯度，没有出现条带。不过用的是rTaq酶，实验室目前没有高保真酶。
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记得心中的那个梦。
15楼2015-10-20 16:59:35
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andywang6137

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15楼: Originally posted by 竹砚 at 2015-10-20 16:59:35
另一对：
>F-b6    5'-GATGTGCAGAAAGGATGGATTACTytngartayga-3'
                                                 degen=32  temp= 60.7
>R-f3    5'-TGAAAATCTGTTTCTGGAATATCTggntcryarca-3'
      ...

你好，你codehop设计的引物扩增出来没有？选定的引怎么用oligo进行评价？谢谢！
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16楼2015-10-26 21:25:47
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