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michacel1217银虫 (小有名气)
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[求助]
肠激酶酶切咨询 已有1人参与
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| 之前构建了一个带有肠激酶酶切位点的融合蛋白，经表达、纯化后使用肠激酶酶切后发现有大量的蛋白沉淀，后来又跑了蛋白胶，发现几乎所有蛋白都集中在沉淀中，其中酶切条件为4℃ 24h，请大神指点一二！ |
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 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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@凌波丽
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luwei13566
木虫 (正式写手)
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- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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从肠激酶处理后跑的蛋白沉淀PAGE上看，处理后的沉淀蛋白大小是否在切割标签后蛋白的理论大小位置附近？上清中是否能检测到标签？能否通过PAGE初步判断肠激酶成功将标签切下来？ 若上面可以初步判断成功切割标签，表明你去除标签的蛋白在当前溶液环境下无法有效溶解。可能有用的措施有:1.在肠激酶处理前，分几个梯度稀释你的蛋白样品，筛查合适的样品浓度。2.稀释肠激酶，分几个酶活梯度处理你的样品，控制肠激酶的切割速率。3.调整一下溶液的pH，避免在蛋白的pI值附近，4.将肠激酶稀释后可适当调高反应温度，避免温度过低。 若上述方法不足以解决问题，则需要加入助溶剂辅助溶解或进行蛋白复性处理。 [ 发自小木虫客户端 ] |
2楼2015-06-30 04:09:33