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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 怎么用碱性磷酸酶处理细胞裂解液，使蛋白质去磷酸化呢？
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水母1992

铁虫 (初入文坛)

[求助] 怎么用碱性磷酸酶处理细胞裂解液，使蛋白质去磷酸化呢？ 已有1人参与

最近做wb发现了一个蛋白总是能杂出两条带，大小相差不大，用SMART软件预测了一下，发现有可能是磷酸化修饰，就想用碱性磷酸酶处理细胞裂解液使蛋白质去磷酸化、不处理的作为对照进行WB实验，观察一下条带有没有差异，但是碱性磷酸酶对裂解液的离子浓度去污剂等有什么要求呢？或者我的思路有什么不妥呢？求大神指教啊！！！！！在线等~~~
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水母
1楼 2015-06-10 18:37:52
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不要用RIPA缓冲液裂解细胞，用PBS之类的做冻融或者用玻璃颗粒做震荡裂解细胞，可以用一些温和的去污剂，比如NP-40. 然后用碱性磷酸酶自带的缓冲液稀释l裂解液到3-5 mg/ml, 加酶常温孵育半个小时
不过大部分情况下，wb出两个条带不是因为翻译后的磷酸化修饰，要么是抗体特异性不好，要么是你的目标蛋白被切掉了
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

水母1992
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2015-06-11 03:56:40
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水母1992

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-11 03:56:40
不要用RIPA缓冲液裂解细胞，用PBS之类的做冻融或者用玻璃颗粒做震荡裂解细胞，可以用一些温和的去污剂，比如NP-40. 然后用碱性磷酸酶自带的缓冲液稀释l裂解液到3-5 mg/ml, 加酶常温孵育半个小时
不过大部分情况下， ...

感谢楼主~~~~
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水母
3楼2015-06-11 09:12:30
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水母1992

铁虫 (初入文坛)
找到文献啦~~~
将上述所得的膜蛋白经碱性磷酸酶处理,以不被处理的样品为对照。碱性磷酸酶反应液10 μl ( 0. 5 mmol /L MgCI2 , 40μg 膜蛋白或离体翻译出蛋白; 0. 002单位碱性磷酸酶) ,对照反应液10μl ( 0. 5 mmol /L MgCI2 , 40μg 膜蛋白或体外翻译出蛋白) , 37℃反应1 h。
——————定点突变法显示在高龄SHR大鼠心_省略_第98位氨基酸可能存在磷酸化修饰_王慧莲
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水母
4楼2015-06-11 09:45:28
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刘瑞君

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 水母1992 at 2015-06-11 09:45:28
找到文献啦~~~
将上述所得的膜蛋白经碱性磷酸酶处理,以不被处理的样品为对照。碱性磷酸酶反应液10 μl ( 0. 5 mmol /L MgCI2 , 40μg 膜蛋白或离体翻译出蛋白; 0. 002单位碱性磷酸酶) ,对照反应液10μl ( 0. 5 mmo ...

请问是neb的吗？是否要加neb buffer啊
对不起和您遇到问题一样，最近我也想做做看。

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5楼2016-09-06 16:53:16
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