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zhangtt0530

新虫 (初入文坛)

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[求助] DNA shuffling道路漫长痛苦，何时解脱？已有1人参与

各位，有做过DNA shuffling的请帮我指点指点，经历了痛苦的三个月，实在是看不到希望，不知道什么时候能解脱。
简单介绍下我的实验背景：载体大小为8000bp，目的片段2500bp，7个模板DNA。DNaseI消化回收250-1000bp片段，无引物PCR电泳状态为弥散带，大小范围高于DNaseI消化带范围。酶切位点HindIII/NotI。
我目前遇到的问题有两个
1、有引物PCR扩增不稳定，有时能扩增到目的条带，有时无法扩增到目的条带，扩增效率不稳定
2、shuffled片段与载体无法连接，转化效率低。单一模板用相同酶切位点引物扩增酶切后与载体连接，可以获得90-100%阳性克隆，每次长出20个左右。shuffled片段连接转化有时长几个，PCR均为阴性，阳性率最高能达到20%。我认为与载体无关，问题很可能出在片段上。
求指点迷津。

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1楼 2015-05-20 10:00:10

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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

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专业: 微生物遗传育种学

有结果了吗？我也在做DNA shuffling，有好多问题都不太懂哎，我无引物pcr 都没有条带连弥散的条带都没有，你无引物PCR怎样设计的？我目的基因有1700bp 左右，酶切后回收0-200bp，确切的讲是100左右，对于PCR程序，我只是加大了延伸时间和改变了循环数，退火温度需要改变吗？请求知道一下，不胜感激！