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DNA shuffling道路漫长痛苦，何时解脱？ 已有1人参与
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各位，有做过DNA shuffling的请帮我指点指点，经历了痛苦的三个月，实在是看不到希望，不知道什么时候能解脱。 简单介绍下我的实验背景：载体大小为8000bp，目的片段2500bp，7个模板DNA。DNaseI消化回收250-1000bp片段，无引物PCR电泳状态为弥散带，大小范围高于DNaseI消化带范围。酶切位点HindIII/NotI。 我目前遇到的问题有两个 1、有引物PCR扩增不稳定，有时能扩增到目的条带，有时无法扩增到目的条带，扩增效率不稳定 2、shuffled片段与载体无法连接，转化效率低。单一模板用相同酶切位点引物扩增酶切后与载体连接，可以获得90-100%阳性克隆，每次长出20个左右。shuffled片段连接转化有时长几个，PCR均为阴性，阳性率最高能达到20%。我认为与载体无关，问题很可能出在片段上。 求指点迷津。 |
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3楼2015-11-06 19:52:15
【答案】应助回帖
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我的pcr也和楼主一样，大多数条带弥散的，结果不稳定偶尔p出一次目的条带，p出的条带稀释100，1000倍2次pcr却还是弥散，请问楼主这个问题是怎么解决的！ 发自小木虫Android客户端 |
4楼2015-11-19 01:33:52
