24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

黄xia

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1302.9
散金: 84
帖子: 129
在线: 47.9小时
虫号: 2375758
注册: 2013-03-25
性别: MM
专业: 兽医免疫学

[交流] 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢已有8人参与

我的蛋白70多KD，上清表达，表达量还可以，在C端加了6His标签，用生工的Ni柱填料挂柱纯化，洗脱后，洗脱液中无目的蛋白，只有杂蛋白，目的蛋白在流穿液当中，说明没挂上，（平衡缓冲液pH8.0，蛋白的等电点4.6左右，上样流速尝试过0.4和0.5ml/min），由于没挂上，打算用切非变性胶的方式纯化，来做后续实验，但将切下的胶电透浓缩后，跑SDS-PAGE分析，有很多杂带，目的条带的量也少，与杂带量差不多，在切的过程中，有时候还切不到自己的目的蛋白，怎么办呀，我已经就纯化蛋白这个问题做了很久了，还没啥进展，希望各位有经验的亲给我一些建议，谢谢谢谢........无数个谢谢。

回复此楼

» 猜你喜欢

1楼 2015-05-09 21:08:14

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

应助: 38 (小学生)
金币: 747
散金: 50
红花: 2
帖子: 247
在线: 54小时
虫号: 4146400
注册: 2015-10-15
专业: 生物化工与食品化工

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄xia: 金币+1 2015-10-27 09:41:10

一般标签蛋白纯化没见过不挂柱的，一般人家都是结合力太强洗不下来。如果不挂柱可能目的蛋白的(His)6标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上,可以考虑溶液环境（pH，离子强度，其他蛋白质分子，缓冲溶液类型，有关影响蛋白质分子表面的试剂等）的因素，可以通过增加所提的蛋白质样品的溶解度来解决；也可能一些蛋白质或DNA与带有(His)6标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用；或者有比邻的组氨酸的污染蛋白质与Ni-NTA柱结合。楼主加油