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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白150KD左右，不知道表达效果会怎么样，想问一下有什么好的方法来纯化
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我是丫丫

木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白150KD左右，不知道表达效果会怎么样，想问一下有什么好的方法来纯化 已有2人参与

我是做分析实验的，对这一块不是很了解，请大神们给个帮助
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
1楼 2015-05-08 08:51:09
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我是丫丫: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-05-20 16:28:35
你的表达蛋白做的是真核表达还是原核表达？原核大分子蛋白表达容易出现降解情况，可以用酵母表达试试。
至于纯化么，还是要看蛋白性质的，我曾经用过分子筛跑大分子蛋白
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-05-08 09:30:29
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我是丫丫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-05-08 09:30:29
你的表达蛋白做的是真核表达还是原核表达？原核大分子蛋白表达容易出现降解情况，可以用酵母表达试试。
至于纯化么，还是要看蛋白性质的，我曾经用过分子筛跑大分子蛋白...

原核表达的！！怎么操作能够避免降解的情况。我的蛋白质粒是有his标签的，打算先过镍柱，分子筛酶用过，但是文献有说，可以详细说一下吗？谢谢老师
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
3楼2015-05-20 16:28:24
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我是丫丫 at 2015-05-20 16:28:24
原核表达的！！怎么操作能够避免降解的情况。我的蛋白质粒是有his标签的，打算先过镍柱，分子筛酶用过，但是文献有说，可以详细说一下吗？谢谢老师...

分子筛的那个只是我举得一个例子，因为蛋白表达与纯化还是要看其本身的性质的。你做的亲和纯化实验我就不说步骤了（网上一搜一大把━┳━　━┳━）
主要就是提出几点建议吧，其一，就是你的蛋白在表达前要保证所有使用仪器的洁净，超声时间不宜过长，培养基中可以添加一些抑制剂；其二，蛋白纯化中，可以在低温中进行试验，添加PMSF类的蛋白酶抑制剂，最主要的就是加快实验速度（一定要快，亲测这是最有效的办法）。如果还是有降解的情况，那就从蛋白的基因优化和宿主菌的选择入手吧。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
4楼2015-05-21 10:11:30
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qc程程
5楼2015-05-21 10:21:29
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

有HIS标签，建议先镍柱，然后镍柱的洗脱峰直接过分子赛。分子赛简单，你的样品加进去直接用低浓度的缓冲液洗就可以了。这个大的分子量用分子筛效果会很好。镍柱若不吸附了，直接过分子赛，柱子长一些，就分的很好的了，祝顺利。
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6楼2015-08-27 13:34:33
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