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wangweigoon

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[求助] 请问链霉亲和素和生物素的结合缓冲用什么呀？能用纯水吗已有1人参与

如题，谢谢大家的指教！

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1楼2015-05-04 11:16:29

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wangweigoon

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为什么每次都没人回答我呢！

说具体一点，我的DNA上标记了生物素，想用链霉亲和素与其结合，购买了1mg的链霉亲和素，不知道用什么条件结合比较好，什么缓冲多少pH值，而且我之后的反应不能含太多氯离子，请大家帮帮忙！

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2楼2015-05-05 09:49:21

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zyyrhy

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wangweigoon: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢你，让我了解到以前不知道的东西！ 2015-06-10 08:27:11

链霉亲和素与生物素的结合在热力学上极端稳定，是已知的最强的非共价键相互作用，其解离常数Kd约为10^-14~10^-15M^-1。其分子机理简介如下：生物素分子在结构上包括三个区域，分别是噻吩环、咪唑酮环和戊酸侧链。这三个部分与链霉亲和素分子上不同的氨基酸侧链形成广泛的相互作用，包括疏水作用、范德华力、氢键等，故此二者一旦结合就极难拆解，文献可考的记录是需要6M盐酸胍，pH1.5. （我个人的经验是，即使在这种极端条件下，也无法完全拆开链霉亲和素-生物素复合物，尤其是链霉亲和素与生物素化的蛋白之间形成的复合物）。
稍微具体点讲，范德华力/疏水作用包括：链霉亲和素的W97与戊酸侧链，W92和W108与咪唑酮环、W120与噻吩环。氢键包括：N23/S27/Y43与咪唑酮环的O原子、S45与咪唑酮环的N原子、N49/S88与戊酸侧链的羧基氧、T90与噻吩环的S，D128与咪唑酮环的N。
除了这些氨基酸侧链介导的相互作用，生物素本身的空间结构与链霉亲和素上的结合位点（口袋状）还具有形状的互补性，此外，生物素的结合还会诱导链霉亲和素构象的变化，尤其是3eta3折叠和beta4折叠之间的loop3-4变构，覆盖在结合位点上，封住了生物素解离的通道。
这些相互作用形成一个复杂的网状结合系统，故而链霉亲和素与生物素的结合在热力学上稳定，在动力学上几乎不可逆。
就你的具体问题而言，只要不是非常极端条件下，链霉亲和素与生物素的结合均可有效进行。3到12 pH范围内，缓冲液的离子强度、pH缓冲成分，去污剂、变性剂等基本不会影响结合。纯水本身pH略偏酸，而不同厂家的链霉亲和素，其等电点通常在6.0~6.5之间，与纯水的pH很接近，此条件下，链霉亲和素容易不可逆的聚集或沉淀，所以你如果用纯水做溶剂的话，链霉亲和素的浓度一定不要太高，最好在0.1mg/ml以下，换算成摩尔浓度的话，约为1.5 uM。
我们公司（西安亚博生物技术有限公司）生产两种高度纯化的链霉亲和素，等电点分别为6.46和6.09，纯度均>=99%，活性分别为>=16和>=17 单位/mg。我们的联系电话为029-81873850，网址为www.abborbio.com。我们现在正好有免费样品试用计划，如需要请与我们联系。

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3楼2015-06-09 23:25:52

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