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[求助]
Red重组不成功，希望各位大侠帮帮忙，指点下小弟。 已有2人参与
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目的：将pKD46的AMP换成博来霉素抗性。菌株：DH5α 1.线性打靶盒子的构建 同源臂长度为35bp，胶回收产物浓度应该够。 2.电转感受态的制备 用试管摇菌过夜，第二天以1%的接种量至含有Amp的40mlLB培养基中，30℃培养1小时后，加入0.3%的L-阿拉伯糖，30℃诱导2小时。冰浴冷却。用10%甘油洗两次，最终浓缩至200ul以10%甘油重悬。 3.电击转化 将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。预冷。 取100ul最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5ul线性打靶盒子，用枪轻轻吸打混匀（因为混匀了感觉效率会高一点）。冰浴2分钟。 电转参数 2500V 200欧 25μF 电击后显示，电击时间为4.8ms。 4.复苏与涂布 加入1ml的LB，30℃，200rpm，1小时。然后涂布在博来霉素平板。涂干。 30℃培养24个小时。 结果：平板上一个菌都木有，好崩溃，各位高手帮帮忙，先谢过了。 |
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