| 查看: 2035 | 回复: 8 | ||
[求助]
Red重组不成功，希望各位大侠帮帮忙，指点下小弟。 已有2人参与
|
|
目的：将pKD46的AMP换成博来霉素抗性。菌株：DH5α 1.线性打靶盒子的构建 同源臂长度为35bp，胶回收产物浓度应该够。 2.电转感受态的制备 用试管摇菌过夜，第二天以1%的接种量至含有Amp的40mlLB培养基中，30℃培养1小时后，加入0.3%的L-阿拉伯糖，30℃诱导2小时。冰浴冷却。用10%甘油洗两次，最终浓缩至200ul以10%甘油重悬。 3.电击转化 将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。预冷。 取100ul最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5ul线性打靶盒子，用枪轻轻吸打混匀（因为混匀了感觉效率会高一点）。冰浴2分钟。 电转参数 2500V 200欧 25μF 电击后显示，电击时间为4.8ms。 4.复苏与涂布 加入1ml的LB，30℃，200rpm，1小时。然后涂布在博来霉素平板。涂干。 30℃培养24个小时。 结果：平板上一个菌都木有，好崩溃，各位高手帮帮忙，先谢过了。 |
回复此楼» 猜你喜欢
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有197人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
-
133 Ų 的极性表面积，如何决定 TNG462 的母液配制与色谱条件
已经有0人回复
-
两个氟原子与一段氨基甲酸甲酯：BLU-5937 的母液配制与稳定性边界
已经有0人回复
-
司美那非（TPN171）：从嘧啶酮母核到工艺放大的结构、色谱与质控参数解析
已经有0人回复
2楼2015-05-08 11:40:12
3楼2015-05-09 22:43:07
4楼2015-05-22 16:04:26
5楼2015-05-23 22:58:53
6楼2015-12-15 17:21:43
7楼2015-12-15 18:44:43
8楼2015-12-15 20:38:50
9楼2015-12-16 11:39:46
