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风随心动

铜虫 (小有名气)

[求助] Red重组不成功，希望各位大侠帮帮忙，指点下小弟。 已有2人参与

目的：将pKD46的AMP换成博来霉素抗性。菌株：DH5α
1.线性打靶盒子的构建
同源臂长度为35bp，胶回收产物浓度应该够。
2.电转感受态的制备
用试管摇菌过夜，第二天以1%的接种量至含有Amp的40mlLB培养基中，30℃培养1小时后，加入0.3%的L-阿拉伯糖，30℃诱导2小时。冰浴冷却。用10%甘油洗两次，最终浓缩至200ul以10%甘油重悬。
3.电击转化
将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。预冷。
取100ul最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5ul线性打靶盒子，用枪轻轻吸打混匀（因为混匀了感觉效率会高一点）。冰浴2分钟。
电转参数
2500V
200欧
25μF
电击后显示，电击时间为4.8ms。
4.复苏与涂布
加入1ml的LB，30℃，200rpm，1小时。然后涂布在博来霉素平板。涂干。
30℃培养24个小时。
结果：平板上一个菌都木有，好崩溃，各位高手帮帮忙，先谢过了。
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偶见繁星梦九天，只愿沧海桑田始如先。
1楼 2015-04-27 16:25:54
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风随心动

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 卡卡罗特zxg at 2015-05-22 16:04:26
1.打靶盒子比例可以相对提高一下 2.同源臂长度40bp 3.最后涂布前先离心，去除部分上清后再重悬涂布  希望对你有帮助。

谢谢，终于有人回复了，好冷清。
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偶见繁星梦九天，只愿沧海桑田始如先。
5楼2015-05-23 22:58:53
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查看全部 9 个回答

华工发酵

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-05-08 13:09:50
同样是新手，想问下你同源臂的长度根据什么设计的？
赞一下 回复此楼
2楼2015-05-08 11:40:12
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风随心动

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 华工发酵 at 2015-05-08 11:40:12
同样是新手，想问下你同源臂的长度根据什么设计的？

根据你打靶的位置啊。
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偶见繁星梦九天，只愿沧海桑田始如先。
3楼2015-05-09 22:43:07
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卡卡罗特zxg

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
风随心动: 金币+10 2015-05-23 22:58:11
1.打靶盒子比例可以相对提高一下 2.同源臂长度40bp 3.最后涂布前先离心，去除部分上清后再重悬涂布  希望对你有帮助。
赞一下 回复此楼
4楼2015-05-22 16:04:26
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