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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 使用Sau3AI建立水稻shotgun库，但连接多次不长，求经验大神帮助
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weleozhu

银虫 (小有名气)

[求助] 使用Sau3AI建立水稻shotgun库，但连接多次不长，求经验大神帮助 已有1人参与

我最近在构建一个水稻的shotgun亚克隆文库，质粒来源是水稻的BAC文库的一个BAC质粒，使用的是PUC19作为载体，回收的片段为7-10K，酶切质粒条件摸索得差不多了，在目的区域也有比较集中的片段，然后切胶回收后，连接到用BamHI酶切然后用NEB CIP脱磷的PUC19上，问题就出在这，连接转化后就是不见一个菌斑。  我转化的菌株是XL1-Blue，用的是电转化， 感受态效率已经经过验证，没有问题，符合建库要求。最近被这个快烦死了，都快两个月了，求求大神棒棒忙，或者改一下方案也行。问题解决了加送金币。
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1楼 2015-04-24 10:38:19
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BAC 文库

新虫 (初入文坛)
盐离子浓度、载体与片段的摩尔比对连接影响很大，可以做个预连接、转化，多摸索几个梯度尝试一下。
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2楼2016-01-18 17:23:56
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BAC 文库

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
weleozhu: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 后面的童鞋可以试试 2016-02-25 17:30:36
今天又看到了该帖，再次说一下我的观点。我建议你换一管新的BamHI 没切载体试一下，然后做一个NEB CIP脱磷前PUC19载体的自连实验，转化后看载体的自连率有多高。上述实验失败，有可能是载体完全没有切开，片段没法连接进去，用CIP脱磷处理后，也不存在载体自连接的情况，故转化后一个菌落都没有。以前我们实验室也碰到过这样的情况。载体酶切时适当的延长酶切的时间，连接时置入4℃冰箱，延长连接的时间。
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3楼2016-02-25 08:43:25
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weleozhu

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by BAC 文库 at 2016-02-25 08:43:25
今天又看到了该帖，再次说一下我的观点。我建议你换一管新的BamHI 没切载体试一下，然后做一个NEB CIP脱磷前PUC19载体的自连实验，转化后看载体的自连率有多高。上述实验失败，有可能是载体完全没有切开，片段没法连 ...

谢谢，我现在没有再做了，马上毕业了，留下来 算是对后来人的一个经验。
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4楼2016-02-25 17:29:49
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